Διερεύνηση της γενετικής ετερογένειας των γονιδίων τεσσάρων αιμοπεταλιακών γλυκοπρωτεϊνικών υποδοχέων και διακυτταρικών συνδέσμων σε γυναίκες με αποβολές και αποτυχίες εμφύτευσης μετά απο εξωσωματική γονιμοποίηση και εμβρυομεταφορά

Abstract

Spontaneous miscarriages are the most common complications of pregnancy, and implantation failures after successful in vitro fertilization and embryo-transfer (IVF-ET failures) constitute the major determinant of total IVF treatment failure. Credible evidence suggests that these disorders share common pathogenetic mechanisms. Genetic thrombophilic factors have been associated with miscarriages, whereas evidence for their role in IVF implantation outcome has been less clear. Glycoproteins Ia (GpIa) and IIIa (GpIIIa) are platelet receptors which mediate sequentially platelet activation and aggregation, while PECAM-1 and P-Selectin are cell adhesion molecules involved in the interactions among platelets, leukocytes and endothelial cells. The aim of this study is to investigate the associations of the genetic heterogeneity GpIa-C807T (rs1126643), GpIIIa-T1565C-PlA1/PlA2 (rs5918), PECAM-1-C373G (Leu125Val) (rs668) and P-Selectin-A37674C (Thr715Pro) (rs6136) with the risk of miscarriages and IVF-ET failures. Material and Methods: Three hundred forty-two women of Greek origin were included in this study. Specifically, 60 nulligravidous women aged 24-40 years with previous IVF-ET failures after exclusion of other known associated etiological factors, 222 nulliparous women aged 23-40 years who experienced spontaneous miscarriages <20 weeks of gestation after natural conception and were tested negative for established risk factors for miscarriages, and 60 fertile controls without history of pregnancy complications or premature cardiovascular events among first-degree relatives, were genotyped for the 4 genetic polymorphisms by pyrosequencing. Relative risk analysis was performed by maternal age and gestational age (early miscarriages: embryonic period, <10 gestational weeks; late miscarriages: fetal period, ≥10 gestational weeks). Genetic models are presented, based on the total number of genetic loci carrying polymorphic alleles (dominant) and the total number of polymorphic alleles (additive) per subject. Statistical analysis was performed by using logistic regression and ROC (Receiver operating characteristic) analysis.Results: All genotype frequencies in cases and controls were in accordance with the Hardy-Weinberg equilibrium. A statistically significant association between the GpIa-C807T genetic heterogeneity and the risk of IVF-ET failure was observed. In comparison with women with the CC genotype, carriers of the GpIa-807T allele had OR=3.45 (95%CI: 1.63-7.30, p=0.001), with the risk being higher for homozygotes TT (OR=7.43, 95%CI: 1.44-38.21, p=0.013) than heterozygotes CT (OR=3.03, 95%CI: 1.39-6.61, p=0.005) (p<0.001 for trend). Additionally, the genetic heterogeneity GpIIIa-T1565C-PlA1/PlA2 was associated with IVF-ET failures risk (carriers of the GpIIIa-PlA2 allele: OR=2.86, 95%CI: 1.27-6.45, p=0.010). Furthermore, PECAM-1-C373G (Leu125Val) genetic heterogeneity was statistically significantly associated with IVF-ET failures, with OR=2.79 (95%CI: 1.10-7.04, p=0.027) for the PECAM-1-373G allele carriers, whereas carriers of the P-Selectin-37674C allele had non-significantly elevated risk (OR=1.59, 95%CI: 0.53-4.78, p=0.406). Additionally, GpIa-C807T and GpIIIa-T1565C-PlA1/PlA2 gene polymorphisms were statistically significantly associated with spontaneous miscarriages. The frequency of GpIa-807T allele carriers was statistically significantly increased in women with miscarriages, compared with fertile controls (OR=3.36, 95%CI: 1.85-6.11, p<0.001). In comparison with subjects with genotype CC/PlA1PlA1, a dose-response relationship was identified, with OR=2.78 (95%CI: 1.49-5.17, p=0.001) for heterozygotes CT, while relative risk was markedly increased for homozygotes TT (OR=8.89, 95%CI: 2.03-38.83, p=0.001) (p<0.001 for trend). Carriers of the GpIIIa-PlA2 allele had OR=2.58 (95%CI: 1.30-5.13, p=0.006). The PECAM-1-373G allele prevalence was higher among women who miscarried, compared with controls, but did not exceed the limit for statistical significance (OR=1.19, 95%CI: 0.62-2.28, p=0.610). Although the association of the genetic heterogeneity P-Selectin-A37674C (Thr715Pro) with recurrent miscarriages was marginally statistically non-significant overall, it was statistically significant for younger women (carriers of the P-Selectin-37674C allele: OR=2.30, 95%CI: 0.91-5.81, p=0.071, <35 years: OR=3, 95%CI: 1.13-7.97, p=0.023, <30 years: OR=6.75, 95%CI: 2.02-22.58, p=0.002). Combined carriers of the GpIa-807T and GpIIIa-PlA2 alleles had remarkably elevated risk of IVF-ET failures (OR=10.13, 95%CI: 2.85-35.99, p<0.001) and miscarriages (OR=9.13, 95%CI: 2.99-27.82, p=0.001), relative to double homozygotes CC/PlA1PlA1, implying synergy between the two alleles. Similarly, an epistatic interaction between the PECAM-1-373G and P-Selectin-37674C alleles was observed, with combined carriers having OR=16.25 (95%CI: 1.44-183.10, p=0.018) for IVF-ET failures and OR=8.81 (95%CI: 1.07-72.50, p=0.024) for miscarriages, in comparison with the genotype CC/AA. The combinative analysis revealed increased risks for miscarriages and IVF-ET failures for other combinations of the four polymorphisms, as well. A very strong positive association for triple carriage of the GpIa-807T, GpIIIa-PlA2 and PECAM-1-373G alleles with IVF-ET failures, relative to the common alleles homozygotes, was determined (OR=52.50, 95%CI: 4.05-680.95, p<0.001). For the first time in the literature genetic models were calculated which predict recurrent IVF-ET failures and miscarriages risk with good diagnostic accuracy (AUC) (IVF-ET failures: 75.4% and 72.5%, miscarriages: 70.4% και 66.9%, based on the number of risk-increasing genes and alleles, respectively). From the quantitative analysis, an increasing trend of IVF-ET failures and miscarriages relative risk with the increasing number of polymorphisms and risk alleles was established. For IVF-ET failures, in comparison with low risk subjects (those with genetic burden in <2 genes), those with >2 polymorphisms had OR=13.50 (95%CI: 3.86-47.22, p<0.001) and carriers of >3 risk alleles had OR=61.56 (95%CI: 3.39-1118.78, p=0.005), as compared with low risk women (those with <2 risk alleles). Furthermore, carriers of >2 polymorphisms had OR=9.15 (95%CI: 3.03-27.63, p<0.001), whereas carriers of >3 risk alleles had OR=36.40 (95%CI: 2.13-621.87, p=0.013) for miscarriages, compared with those with <2 polymorphic genes and alleles. The above associations were more pronounced among younger women and for late miscarriages. Conclusions: This study provides epidemiological evidence supporting the role of the GpIa-807T, GpIIIa-PlA2, PECAM-1-373G and P-Selectin-37674C alleles in the pathogenesis of unexplained spontaneous abortions and IVF-ET failures, revealing the importance of platelet-associated inherited thrombophilia in women with fetal loss across the different stages of pregnancy, from implantation to the point of embryo viability. The presented genetic associations and genetic models could be used for the prediction of women with unexplained miscarriages and IVF-ET failures as well as the individualization of antiplatelet therapy.

Οι αυτόματες αποβολές είναι οι συχνότερες επιπλοκές της εγκυμοσύνης και οι αποτυχίες εμφύτευσης μετά από επιτυχή εξωσωματική γονιμοποίηση και εμβρυομεταφορά (αποτυχίες IVF-ET) αποτελούν τον κυριότερο παράγοντα αποτυχίας της συνολικής IVF θεραπείας. Υπάρχουν αρκετές ενδείξεις ότι οι παραπάνω διαταραχές μοιράζονται κοινούς παθογενετικούς μηχανισμούς. Γενετικοί θρομβοφιλικοί παράγοντες έχουν συσχετιστεί με τις αποβολές ενώ οι ενδείξεις για τον ρόλο τους στην έκβαση της εμφύτευσης μετά από IVF είναι λιγότερο σαφείς. Οι γλυκοπρωτεΐνες Ia (GpIa) και IIIa (GpIIIa) είναι υποδοχείς των αιμοπεταλίων με διαδοχική συμμετοχή στην αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση και συσσώρευση ενώ το PECAM-1 και η P-Selectin αποτελούν μόρια διακυτταρικής σύνδεσης που εμπλέκονται στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ αιμοπεταλίων, λευκοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση των συσχετίσεων της γενετικής ετερογένειας των γονιδίων GpIa-C807T (rs1126643), GpIIIa-T1565C-PlA1/PlA2 (rs5918), PECAM-1-C373G (Leu125Val) (rs668) και P-Selectin-A37674C (Thr715Pro) (rs6136) με τον κίνδυνο αποβολών και αποτυχιών IVF-ET. Υλικό και Μέθοδοι: Στην μελέτη περιλήφθηκαν συνολικά 342 γυναίκες Ελληνικής καταγωγής. Συγκεκριμένα, 60 άτοκες γυναίκες ηλικίας 24-40 ετών με ιστορικό αποτυχιών IVF-ΕΤ αφού είχαν υποβληθεί σε πλήρη έλεγχο για τον αποκλεισμό άλλων πιθανών σχετιζόμενων αιτιολογικών παραγόντων, 222 άτοκες γυναίκες ηλικίας 23-40 ετών με ιστορικό αποβολών <20 εβδομάδες κύησης μετά από φυσιολογική σύλληψη που ήταν αρνητικές στους γνωστούς παράγοντες κινδύνου αποβολής και 60 γόνιμες γυναίκες χωρίς ιστορικό επιπλοκών στην κύηση ή πρώιμων καρδιαγγειακών επεισοδίων σε συγγενείς 1ου βαθμού, διερευνήθηκαν για την παρουσία των 4 γενετικών πολυμορφισμών με πυροαλληλούχιση. Η ανάλυση του σχετικού κινδύνου αποβολών και αποτυχιών IVF-ET έγινε κατά ηλικία της γυναίκας και ηλικία κύησης (πρώιμες αποβολές: εμβρυονική περίοδος, <10 εβδομάδες κύησης, όψιμες αποβολές: εμβρυϊκή περίοδος, ≥10 εβδομάδες κύησης). Παρουσιάζονται γενετικά μοντέλα με βάση τον συνολικό αριθμό των γονιδιακών θέσεων που φέρουν πολυμορφικά αλληλόμορφα (επικρατές μοντέλο) και των πολυμορφικών αλληλόμορφων (αθροιστικό μοντέλο) ανά γυναίκα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με εφαρμογή λογαριθμιστικής παλινδρόμησης και με ανάλυση ROC (Receiver operating characteristic). Αποτελέσματα: Όλες οι γονοτυπικές συχνότητες σε ασθενείς και μάρτυρες ήταν σε συμφωνία με την ισορροπία Hardy-Weinberg. Διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της γενετικής ετερογένειας GpIa-C807T με τον κίνδυνο αποτυχίας IVF-ET. Σε σύγκριση με τις γυναίκες με γονότυπο CC, οι φορείς του αλληλόμορφου GpIa-807T είχαν OR=3,45 (95%CI: 1,63-7,30, p=0,001), με υψηλότερο κίνδυνο για τις ομόζυγες ΤΤ (OR=7,43, 95%CI: 1,44-38,21, p=0,013), από τις ετερόζυγες CT (OR=3,03, 95%CI: 1,39-6,61, p=0,005) (p<0,001 for trend). Επίσης, διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της γενετικής ετερογένειας GpIIIa-T1565C-PlA1/PlA2 με τις αποτυχίες IVF-ET (φορείς του αλληλόμορφου GpIIIa-PlA2: OR=2,86, 95%CI: 1,27-6,45, p=0,010). Περαιτέρω, διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της γενετικής ετερογένειας PECAM-1-C373G (Leu125Val) με τις αποτυχίες IVF-ET, με OR=2,79 (95%CI: 1,10-7,04, p=0,027) για τις φορείς του αλληλόμορφου PECAM-1-373G, ενώ οι φορείς του αλληλόμορφου P-Selectin-37674C είχαν μη στατιστικά σημαντικά αυξημένο κίνδυνο (OR=1,59, 95%CI: 0,53-4,78, p=0,406). Επιπρόσθετα, αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της γενετικής ετερογένειας GpIa-C807T και GpIIIa-T1565C-PlA1/PlA2 με τις αυτόματες αποβολές. Η συχνότητα των φορέων του αλληλόμορφου GpIa-807T ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη στις γυναίκες με αποβολές, σε σύγκριση με τις γόνιμες μάρτυρες (OR=3,36, 95%CI: 1,85-6,11, p<0,001). Σε σύγκριση με τις γυναίκες με γονότυπο CC/PlA1PlA1, διαπιστώθηκε δοσο-εξαρτώμενη σχέση, με OR=2,78 (95%CI: 1,49-5,17, p=0,001) για τις ετερόζυγες CT, ενώ ο σχετικός κίνδυνος αυξανόταν σημαντικά για τις ομόζυγες TT (OR=8,89, 95%CI: 2,03-38,83, p=0,001) (p<0,001 for trend). Οι φορείς του αλληλόμορφου GpIIIa-PlA2 είχαν OR=2,58 (95%CI: 1,30-5,13, p=0,006). Ο επιπολασμός του αλληλόμορφου PECAM-1-373G ήταν υψηλότερος μεταξύ των γυναικών με αποβολές, συγκριτικά με τις μάρτυρες, χωρίς όμως να ξεπερνά τα όρια της στατιστικής σημαντικότητας (OR=1,19, 95%CI: 0,62-2,28, p=0,610). Αν και η συσχέτιση της γενετικής ετερογένειας P-Selectin-A37674C (Thr715Pro) με τις επαναλαμβανόμενες αποβολές ήταν συνολικά οριακά στατιστικά μη σημαντική, ήταν στατιστικά σημαντική για τις νεότερες γυναίκες (φορείς του αλληλόμορφου P-Selectin-37674C: συνολικά: OR=2,30, 95%CI: 0,91-5,81, p=0,071, <35 ετών: OR=3, 95%CI:1,13-7,97, p=0,023, <30 ετών: OR=6,75, 95%CI: 2,02-22,58, p=0,002). Οι φορείς του συνδυασμού των αλληλόμορφων GpIa-807T και GpIIIa-PlA2 είχαν αξιοσημείωτα υψηλό κίνδυνο αποτυχιών IVF-ET (OR=10,13, 95%CI: 2,85-35,99, p<0,001) και αποβολών (OR=9,13, 95%CI: 2,99-27,82, p<0,001), έναντι των διπλά ομόζυγων CC/PlA1PlA1, υποδεικνύοντας συνέργεια των δύο αλληλόμορφων. Παρόμοια, παρατηρήθηκε επιστατική αλληλεπίδραση των αλληλόμορφων PECAM-1-373G και P-Selectin-37674C, με τις συνδυαστικούς φορείς να έχουν OR=16,25 (95%CI: 1,44-183,10, p=0,018) για τις αποτυχίες IVF-ET και OR=8,81 (95%CI: 1,07-72,50, p=0,024) για τις αποβολές, σε σύγκριση με τον γονότυπο CC/AA. Η συνδυαστική ανάλυση ανέδειξε αυξημένο κίνδυνο αποβολών και αποτυχιών IVF-ET και για μια σειρά άλλων συνδυασμών των τεσσάρων πολυμορφισμών. Πολύ ισχυρή θετική συσχέτιση προσδιορίστηκε για την τριπλή φορεία των αλληλόμορφων GpIa-807T, GpIIIa-PlA2 και PECAM-1-373G έναντι των φορέων των κοινών αλληλόμορφων για τις αποτυχίες IVF-ET (OR=52,50, 95%CI: 4,05-680,95, p<0,001). Για πρώτη φορά στην βιβλιογραφία προσδιορίστηκαν γενετικά μοντέλα που εκτιμούν τον κίνδυνο επαναλαμβανόμενων αποτυχιών IVF-ET και αποβολών με καλή διαγνωστική ακρίβεια (AUC) (αποτυχίες IVF-ET: 75,4% και 72,5%, αποβολές: 70,4% και 66,9% με βάση τον αριθμό των γονιδίων και αλληλόμορφων κινδύνου, αντίστοιχα). Από την ποσοτική ανάλυση διαπιστώθηκε σαφής αυξητική τάση του σχετικού κινδύνου αποτυχιών IVF-ET και αποβολών με την αύξηση του αριθμού των πολυμορφισμών και των πολυμορφικών αλληλόμορφων. Για τις αποτυχίες IVF-ET, σε σύγκριση με τις γυναίκες χαμηλού κινδύνου (αυτές με γενετική επιβάρυνση σε <2 γονίδια), οι γυναίκες με >2 πολυμορφισμούς είχαν OR=13,50 (95%CI: 3,86-47,22, p<0,001) και οι φορείς >3 αλληλόμορφων κινδύνου είχαν OR=61,56 (95%CI: 3,39-1.118,78, p=0,005), σε σύγκριση με τις γυναίκες χαμηλού κινδύνου (αυτές με <2 αλληλόμορφα κινδύνου). Αντίστοιχα, για τις αποβολές, οι φορείς >2 πολυμορφισμών είχαν OR=9,15 (95%CI: 3,03-27,63, p<0,001) και οι φορείς >3 αλληλόμορφων κινδύνου είχαν OR=36,40 (95%CI: 2,13-621,87, p=0,013), σε σύγκριση με αυτές με <2 πολυμορφικά γονίδια και αλληλόμορφα, αντίστοιχα. Οι παραπάνω συσχετίσεις ήταν ισχυρότερες για τις νεότερες γυναίκες καθώς και για τις όψιμες αποβολές. Συμπεράσματα: Από την παρούσα μελέτη τεκμαίρεται επιδημιολογικά σημαντικός ρόλος για τα αλληλόμορφα GpIa-807T, GpIIIa-PlA2, PECAM-1-373G και P-Selectin-37674C στην παθογένεια των ανεξήγητων αυτόματων αποβολών και αποτυχιών IVF-ET, αναδεικνύοντας την σημασία της αιμοπεταλιογενούς γενετικής θρομβοφιλίας στην απώλεια του κυήματος σε όλο το φάσμα της κύησης, από την εμφύτευση ως την χρονική περίοδο της βιωσιμότητας του εμβρύου. Οι προτεινόμενες γενετικές συσχετίσεις και γενετικά μοντέλα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη των γυναικών με ανεξήγητες αποβολές και αποτυχίες IVF-ET, καθώς και την εξατομίκευση της αντιαιμοπεταλιακής αγωγής.