Η επίδραση καροτενοειδών του κρόκου του ήμερου (Crocus Sativus Linneaus) σε ποιοτικά χαρακτηριστικά του σπέρματος του ταύρου και στην in vitro γονιμοποίηση

Abstract

The handling and culture of gametes and embryos in vitro renders them susceptible to high risk of oxidative stress, mainly due to their exposure in an environment with higher PO2 to that of the female genital tract. Oxidative stress is one the most important factors that contribute to poor semen quality and low rates of in vitro fertilization. Although, low and regulated amounts of Reactive Oxygen Species (ROS) are mandatory of crucial reproductive processes, such as capacitation and sperm-oocyte fusion, an imbalance between ROS and antioxidants in spermatozoa may result in loss of their structural integrity and functionality. For several decades, an intensive search for optimization of in vitro techniques has led to the employment of several antioxidants in the culture media, in order to counteract the negative effects of the ROS that are generated during these processes, on sperm quality and fertilizing capacity. Among these are extracts or compounds of the plant Crocus sativus L. (saffron), whose antioxidant properties have been demonstrated both in vitro and in vivo. The aim of the present study was to investigate whether supplementation of sperm preparation media with crocin (0.5, 1 and 2mM) or crocetin (1, 2.5 and 5μΜ), carotenoids of Crocus sativus, maintains the quality of bovine thawed sperm and decipher the mechanism by which it does so. In addition, the same carotenoids were evaluated for their effect(s) on in vitro fertilization process, by means of cleavage and blastocyst rates. For this purpose, bovine frozen spermatozoa and oocytes from abattoir ovaries were used. Spermatozoa were incubated for 0, 2 and 4 hours, in the presence or absence (control) the three different concentrations of crocin or crocetin, and were evaluated in terms of motility, viability, DNA integrity, acrosomal status, phosphatidylserine (PS) translocation, intracellular levels of O2- H2O2 and lipid peroxidation. In order to evaluate the impact of crocin and crocetin on cleavage and blastocyst rate, the compounds were added in the IVF medium at the previously identified optimal concentration. Based on the experimental results, we propose that crocin (1mM) or crocetin, (2,5μΜ) preserve sperm motility, viability and DNA integrity, by regulating the intracellular levels of ROS and lipid peroxidation. This observation is verified by the higher percentage of acrosome reacted spermatozoa, as well as the higher blastocyst production in vitro.

Τα κύτταρα (σπερματοζωάρια, ωοκύτταρα, έμβρυα) που συμμετέχουν στην in vitro γονιμοποίηση υφίστανται έντονο οξειδωτικό στρες κατά τη διάρκεια των χειρισμών και της καλλιέργειάς τους, καθώς οι συνθήκες κάτω από τις οποίες πραγματοποιούνται οι χειρισμοί χαρακτηρίζονται από υψηλή συγκέντρωση οξυγόνου. Το οξειδωτικό στρες αποτελεί μία από τις κυριότερες αιτίες της υποβάθμισης της ποιότητας του σπέρματος και των χαμηλών ποσοστών επιτυχίας της in vitro γονιμοποίησης. Υψηλές συγκεντρώσεις δραστικών μορφών οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS) θίγουν τη δομική και λειτουργική ακεραιότητα των γαμετών. Ωστόσο, μικρές και ελεγχόμενες συγκεντρώσεις ROS είναι απαραίτητες, καθώς ρυθμίζουν βασικές φυσιολογικές διεργασίες της αναπαραγωγής, όπως είναι η ενεργοποίηση των σπερματοζωαρίων και η συγχώνευση των γαμετών. Τα τελευταία χρόνια η επιστημονική κοινότητα έχει στραφεί στην προσθήκη αντιοξειδωτικών παραγόντων στα υποστρώματα της in vitro παραγωγής εμβρύων προκειμένου να αποσοβήσουν τον κίνδυνο που εγκυμονούν οι υψηλές συγκεντρώσεις ROS στη γονιμοποιητική ικανότητα του σπέρματος και στα ποσοστά επιτυχίας της in vitro γονιμοποίησης. Οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος των στύλων του κρόκου του ήμερου (Crocus. sativus L.) έχουν μελετηθεί τόσο in vivo, όσο και in vitro. Έτσι, η πιθανή αντιοξειδωτική δράση του κρόκου του ήμερου έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον να μελετηθεί σε κύτταρα που υφίστανται έντονο οξειδωτικό στρες, όπως αυτά που συμμετέχουν στην in vitro γονιμοποίηση. Στη διατριβή αυτή διερευνάται η επίδραση δύο κύριων βιολογικώς ενεργών συστατικών του κρόκου του ήμερου, της κροκίνης και της κροκετίνης, στη γονιμοποιητική ικανότητα του κατεψυγμένου σπέρματος ταύρου in vitro. Για το σκοπό της αυτό χρησιμοποιήθηκαν κατεψυγμένα σπερματοζωάρια ταύρου και ωοκύτταρα από ωοθήκες αγελάδων, ύστερα από τη μεταθανάτια συλλογή τους. Ελέγχθηκε η επίδραση 3 διαφορετικών συγκεντρώσεων κροκίνης (0,5mM, 1mM και 2mM) και κροκετίνης (1μΜ, 2,5μΜ και 5μΜ) σε ποιοτικές παραμέτρους του σπέρματος, όπως η κινητικότητα, η ζωτικότητα, η ενεργοποίηση/αντίδραση ακροσώματος, η ακεραιότητα του DNA, τα ενδοκυτταρικά επίπεδα της ρίζα του ανιόντος υπεροξειδίου και του υπεροξειδίου του υδρογόνου, το ποσοστό μετάθεσης της φωσφατιδυλοσερίνης στην εξωτερική κυτταρική μεμβράνη και ο βαθμός της λιπιδικής υπεροξείδωσης των κυτταρικών μεμβρανών. Η αξιολόγηση των παραπάνω παραμέτρων πραγματοποιήθηκε σε 3 χρονικά σημεία: 0 ώρα, 2 ώρες και 4 ώρες επώασης. Η επιβεβαίωση της βελτίωσης της γονιμοποιητικής ικανότητας του σπέρματος από την παρουσία των δύο καροτενοειδών έγινε με την τροποποίηση του υποστρώματος της in vitro γονιμοποίησης και τον έλεγχο του ποσοστού αυλάκωσης και των παραγόμενων βλαστικών κύστεων, παρουσία αρνητικού μάρτυρα. Από την εκτίμηση των αποτελεσμάτων προκύπτει ότι η επώαση του σπέρματος παρουσία της κροκίνης (1mM) και της κροκετίνης (2,5μΜ) διασφαλίζει ελεγχόμενα ποσά ROS και λιπιδικών υδροϋπεροξειδίων. Ο αντιοξειδωτικός αυτός ρόλος προστατεύει, σύμφωνα με τα αποτελέσματα, την κινητικότητα, τη ζωτικότητα και την ακεραιότητα του DNA, ιδιότητες που συνδέονται άρρηκτα με τη γονιμοποιητική ικανότητα του σπέρματος. Η τελευταία επιβεβαιώνεται μέσω της σημαντικής αύξησης του ποσοστού των σπερματοζωαρίων με αντίδραση ακροσώματος και των παραγόμενων βλαστικών κύστεων, συγκριτικά με το μάρτυρα.