Μελέτη έκφρασης γονιδίων αρχέγονων βλαστικών κυττάρων σε τροφοβλαστικά κύτταρα

Abstract

IntroductionTraditionally, mesenchymal stem cells (MSCs) can be obtained from a big number of human tissues. Recently, MSCs have been isolated from extraembryonic sources, such as cord blood, Wharton’s Jelly, amniotic membranes, amniotic fluid and placenta. MSCs derived from placental chorionic villi of the first trimester are likely to resemble, biologically, embryonic stem cells (ESC), due to the earlier development stage of placenta.In the present study, we are attempting to unravel the common features between the MSCs, obtained from placental chorionic villi of the first trimester, and ESC. In the light of former studies, long-term cultures of MSCs were assessed in order to evaluate MSCs in vitro differentiation potential, molecular features and markers of pluripotency during the period of culture.Materials and MethodsMSCs were obtained from 30 samples of chorionic villus and cultured to estimate their proliferative capacity, karyotyping stability and morphological characteristics. Flow cytometry was used to determine the expression of MSCs-surface antigens. MSCs were differentiated into adipocytes, osteoblasts, chondrocytes and neuronal cells. RT-PCR expression analysis of ESC-gene markers and differentiation-gene markers were followed to evaluate the differentiation success. ResultsChorionic villi cells, which were growing easily in culture conditions, appear to be phenotypically stable and displayed typical fibroblastoid morphology. MSCs cultures were undergone 20 passages during a period of 120 days, maintaining a stable karyotype throughout long term expansion. MSCs expansion rate was stable at the earlier stages (passages 3-12), and drop at the later (passages 13-20).Flow cytometry analysis has shown that the chorionic villi cells were positive, for CD90, CD73, CD105, CD29, CD44, HLA ABC antigens and negative for CD14, CD34, AC133, and HLA DR antigens, over the entire period of culture.Chorionic villi-derived MSCs were successfully differentiated in adipocytes, osteoblasts, chondrocytes and neuronal cells. Differentiation was confirmed by Oil Red O, Alizarin Red S, Alcian Blue and Cresyl Violet staining respectively and expression of PPARγ2, SPP1, Sox9 and Nes respectively.The expression of the ESC-gene markers POU5F1 (Oct-4) and NANOG was observed at earliest stages (4-12 passages), while the late stages (14-20 passages) did not presented any detectable expression levels. ZFP42 and SOX2 expression were not detected. Moreover, MSCs were found to express GATA4 but not NES (Nestin).ConclusionsChorionic villi-derived MSCs possess multipotent properties between embryonic and adult stem cells. In the present study with the use of a wider range of markers, it was found that chorionic villi MSCs display high proliferation rate and self-renew capacity, share common surface antigens with adult MSCs and express certain embryonics stem cells gene markers. These characteristics highlight chorionic villi as an attractive source of MSCs for the needs of regenerative medicine

ΕισαγωγήΠαραδοσιακά τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) μπορούν να προκύψουν από πληθώρα ανθρώπινων ιστών. Πρόσφατα, MSCs απομονώθηκαν από εξωεμβρυϊκές πηγές όπως το ομφαλικό αίμα και η γέλη του Wharton, οι αμνιακές μεμβράνες, το αμνιακό υγρό και ο πλακούντας. ΜSCs προερχόμενα από πλακουντιακές χοριακές λάχνες πρώτου τριμήνου φαίνεται να ομοιάζουν, βιολογικά, στα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ESCs), λόγω του πρώιμου σταδίου ανάπτυξης του πλακούντα.Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να διαλευκάνουμε τα κοινά χαρακτηριστικά μεταξύ των MSCs προερχόμενα από πρώτου τριμήνου χοριακές λάχνες και ESC. Με βάση τα δεδομένα προηγούμενων μελετών, πραγματοποιήθηκαν παρατεταμένες χρονικά καλλιέργειες των MSCs με σκοπό να αξιολογηθούν in vitro, πως διαμορφώνονται το δυναμικό διαφοροποίησης, τα μοριακά χαρακτηριστικά και γενικότερα οι δείκτες πολυδυναμοκότητας καθόλη τη περίοδο καλλιέργειας.Υλικά και ΜέθοδοιMSCs ελήφθησαν από 30 δείγματα χοριακών λαχνών και καλλιεργήθηκαν για να εκτιμηθεί η ικανότητα πολλαπλασιασμού τους και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά. Κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση των αντιγόνων επιφανείας των MSCs. Τα MSCs διαφοροποιήθηκαν σε λιποκύτταρα, οστεοβλάστες, χονδροκύτταρα και νευρικά κύτταρα. Μέσω RT-PCR ανάλυθηκε η έκφραση των γονιδίων-δεικτών των ESC και των γονιδίων δεικτών της διαφοροποίησης.ΑποτελέσματαΤα χοριακά λαχνικά κύτταρα, αναπτύσσονται εύκολα, είναι φαινοτυπικά σταθερά με χαρακτηριστική ινοβλαστοειδή μορφολογία. MSCs ανακαλλιεργήθηκαν για 20 φορές κατά τη διάρκεια περιόδου 120 ημερών. Ρυθμός πολλαπλασιασμού των MSCs παρέμενε σταθερός στα πρώιμα στάδια (3η-12η ανακαλλιέργεια) και παρουσίασε πτώση στα μεταγενέστερα στάδια (13η-20η ανακαλλιέργεια). Καθόλη τη διάρκεια της παρατεταμένης χρονικά καλλιέργειας ο καρυότυπος των κυττάρων δεν τροποποιηθήκε.Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι τα κύτταρα χοριακών λαχνών ήταν θετικά για CD90, CD73, CD105, CD29, CD44, HLA ABC αντιγόνα και αρνητικά για CD14, CD34, AC133, και HLA DR αντιγόνα, για ολόκληρη την περίοδο καλλιέργειας.Τα από χοριακές λάχνες προερχόμενα MSCs διαφοροποιήθηκαν επιτυχώς σε λιποκύτταρα, οστεοβλάστες, χονδροκύτταρα αλλά και σε νευρικά κύτταρα. Διαφοροποίηση επιβεβαιώθηκε με χρώσεις Oil Red Ο, Alizarin Red S, Alcian Blue και Cresyl Violet αντίστοιχα και έκφραση των γονιδίων PPARγ2, SPP1, Sox9 και Νεστίνης αντίστοιχα.Η έκφραση ESCs γονιδίων-δεικτών POU5F1 (Οct-4) και Nanog παρατηρήθηκε σε πρώιμα στάδια (4-12 περάσματα), ενώ τα τελευταία στάδια (14-20 περάσματα) δεν παρουσίασαν ανιχνεύσιμα επίπεδα έκφρασης. ZFP42 και Sox2 έκφραση δεν παρατηρήθηκε. Επιπλέον, MSCs βρέθηκαν να εκφράζουν το γονίδιο GATA4 αλλά όχι το NES (νεστίνη) σε μη διαφοροποιημένα κύτταρα.ΣυμπεράσματαΤα από χοριακές λάχνες προερχόμενα MSCs έχουν πολυδύναμες ιδιότητες μεταξύ εμβρυϊκών και ενήλικων βλαστικών κύτταρα. Στην παρούσα μελέτη με τη χρήση ενός ευρύτερου φάσματος δεικτών, διαπιστώθηκε ότι MSC από χοριακές λάχνες εμφανίζουν υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, διατηρώντας αναλλοίωτο το χρωμοσωμικό τους προφίλ, και την αυτό-ανανεωτική ικανότητα τους, μοιράζονται κοινή έκφραση αντιγόνων επιφάνειας με τα ενήλικα MSCs και εκφράζουν ορισμένα γονίδια μάρτυρες των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων. Αυτά τα χαρακτηριστικά θέτουν τις χοριακές λάχνες ως μια ελκυστική πηγή MSC για τις ανάγκες της αναγεννητικής ιατρικής.