In Vivo μελέτη της συμβολής της φωσφορυλίωσης των MAP κινασών στην αποπτωτική διαδικασία της σήψης

Abstract

The impact of a potential autophagy (LC3a/b) deregulation in hyper and in hypo stages during sepsis-induced kidney injury and the temporal profile of phosphorylated extracellular signal-related kinase, P38 (pP38), Akt (pAKT), and 13- 3-3b protein were investigated in the current study, using a rat cecal ligation and puncture (CLP) model, by means of flow cytometry and immunohistochemistry. Cell viability was assessed by protein C zymogen concentrate (PC), 7-aminoactinomycin D (7-AAD) staining and inflammation by S100 protein immunostaining. The impact of reduced kidney inflammation in autophagy was assessed by PC administration, an anti-inflammatory and cytoprotective substance. Sepsis induction increased LC3a/b expression, which presented two peaks at 6 and 36 h after CLP, both in the percentage of positive cells (P=0.024, P=0.025, respectively) and in fluorescence intensity. At 6h when inflammation was already apparent, LC3a/b increase was escorted by phosphorylated extracellular signal-related kinase stimulation and high cell viability (65%), designating autophagy as a cytoprotective mechanism against microbial infection. The phosphorylation of P38 was delayed to 12h after CLP, when autophagy was reduced. pAkt and 14-3-3b expression was stimulated between 6 and 36h after CLP, although a slight inhibition of pAkt within each cell was detected (lower MnIX value). During the second peak, inflammation was intensified, necrosis was significantly increased with LC3a/b+/7-AAD+ cells to present a 1.5-fold increase. Protein C zymogen concentrate administration declined autophagy at 6 and 36 h after CLP and reduced necrosis, whereas double positive LC3a/b and 7-AAD cells were increased 1.68 and 2.78-fold, respectively. These data open new prospectives in sepsis treatment, since they further support that autophagy represents a cytoprotective mechanism triggered by stress conditions, rather than an alternative cell death pathway.

Ο αντίκτυπος μιας πιθανής απορρύθμισης της αυτοφαγίας (LC3a/b) στα υπερ- και υπο- δυναμικά στάδια της νεφρικής βλάβης κατά τη διάρκεια της σήψης και το προφίλ της χρονικής κατανομής των ενεργοποιημένων MAP κινασών pERK και pP38, της κινάσης pAKT και της πρωτεΐνης 14- 3-3b ερευνήθηκαν στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο τρώσης και απολίνωσης τυφλού (CLP) αρουραίου. Η ανάλυση έγινε με τη βοήθεια της κυτταρομετρίας ροής και της ανοσοϊστοχημείας. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με 7-αμινοακτινομυκίνη D (7-AAD) και η φλεγμονή με ανοσοϊστοχημική χρώση των πρωτεϊνών S100. Η επίδραση που έχει η μείωση της φλεγμονής στον νεφρό στην αυτοφαγία και στα υπόλοιπα ρυθμιστικά μόρια εκτιμήθηκε με χορήγηση πρωτεΐνης C (PC), μίας αντι-φλεγμονώδους και κυτταροπροστατευτικής ουσίας. Η επαγωγή σήψης ενίσχυσε την έκφραση της LC3a/b, η οποία παρουσίασε δύο κορυφές στις 6 και τις 36 ώρες μετά τη CLP, τόσο στο ποσοστό των θετικών κυττάρων (Ρ=0,024, Ρ=0.025, αντίστοιχα) όσο και στην ένταση φθορισμού. Στις 6 ώρες, όταν η φλεγμονή ήταν ήδη εμφανής, η αύξηση της LC3a/b συνοδεύτηκε από ενεργοποίηση της ERK και υψηλή βιωσιμότητα των κυττάρων (65%), που υποδηλώνει πως η αυτοφαγία είναι ένας κυτταροπροστατευτικός μηχανισμός κατά της μικροβιακής μόλυνσης. Η φωσφορυλίωση της Ρ38 αυξήθηκε 12h μετά τη CLP, όταν η αυτοφαγία μειώθηκε. Η έκφραση της pAkt και της 14-3-3b διεγείρεται μεταξύ 6 και 36 ωρών μετά τη CLP, αν και ανιχνεύθηκε μια ελαφρά αναστολή της pAkt μέσα σε κάθε κύτταρο (κατώτερη τιμή MnIX). Κατά τη δεύτερη κορυφή της αυτοφαγίας, η φλεγμονή εντάθηκε, η νέκρωση ήταν σημαντικά αυξημένη με τα LC3a/b+/7-AAD+ κύτταρα να παρουσιάζουν αύξηση κατά 1.5 φορά. Η χορήγηση πρωτεΐνης C μείωσε την αυτοφαγία και τη νέκρωση στις 6 και τις 36 ώρες μετά τη CLP, ενώ τα διπλά θετικά LC3a/b και 7-AAD κύτταρα αυξήθηκαν 1,68 και 2,78 φορές αντίστοιχα. Τα στοιχεία αυτά ανοίγουν νέες προοπτικές στη θεραπεία της σήψης, καθώς επίσης υποστηρίζουν ότι η αυτοφαγία αποτελεί έναν κυτταροπροστατευτικό μηχανισμό που ενεργοποιείται από συνθήκες στρες, αντί για ένα εναλλακτικό μονοπάτι κυτταρικού θανάτου.