Μελέτη πρωτεϊνικών βιοδεικτών στον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως

Abstract

Bladder cancer (BC) is the second in incidence and first in mortality cancer of the genitourinary system, characterized by the highest recurrence rate of all malignancies. Due to high relapse rates, frequent patient monitoring is required, leading to augmented associated healthcare costs and diminished patient compliance. A prevailing need for non-invasive biomarkers which will facilitate the timely diagnosis of primary and recurrent BC remains unmet to date. Moreover, tumor invasion results in poor prognosis, with more than 50% of the patients dying of the disease within 5 years. Therefore, thorough understanding of the underlying molecular processes is needed to guide the development of appropriate therapeutic approaches. This study is, one the one hand, focused on the investigation of biomarker panels based on urinary peptides, as screening tools for the diagnosis of urothelial bladder cancer. In parallel, and in order to unravel the mechanisms underlying disease progression, we have investigated the role of Profilin-1 in BC invasiveness. Capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry (CE-MS) was employed for the identification of urinary peptide biomarkers. Two biomarker panels were developed for detecting primary and recurrent BC, by employing 1357 urine samples. Cystoscopy was applied for detecting BC, while patients negative for recurrence had follow-up for at least one year to exclude presence of an undetected tumor at the time of sampling. The candidate urine-based peptide biomarker panels were derived from case-control statistical comparison in primary (n=451) and recurrent (n=425) BC. Two biomarker panels were developed based on 116 and 106 peptide biomarkers using support vector machine algorithms. Validation of the urine-based biomarker panels in independent validation sets, resulted in AUC values of 0.87 and 0.75 for detecting primary (n=270) and recurrent BC (n=211), respectively. At the optimal cut-off, the classifier for detection of primary BC, presented sensitivity of 91% and specificity of 68%, while the classifier for recurrence demonstrated 87% sensitivity and 51% specificity. Improved performance was achieved when combining the urine-based panel with cytology (AUC of 0.87).To gain a better understanding in the mechanisms underlying disease progression, recent proteomic studies from our laboratory revealed correlation of the Profilin-1 (PFN1) protein and BC invasiveness. Profilins are actin binding proteins with additional phosphatidylinositol binding properties, and with attributed pleiotropic functions to cytoskeletal remodeling, cell adhesion, motility, and even transcriptional regulation, of yet not well characterized underlying molecular interactions. Earlier studies from our laboratory supported an association of Profilin-1 (PFN1) with BC progression. To get an insight into the biological role of PFN1 in BC, herein, we describe a comprehensive analysis of the impact of PFN1 silencing via shRNA, in vitro (T24M cells) and in vivo (T24M xenografts in NOD/SCID mice) using a combination of phenotypic (monitoring of proliferation, cell adhesion, motility, tumor growth, apoptosis and actin polymerization) and molecular (flow cytometry for cell surface molecules, secretome arrays and RNA sequencing) assays. The results collectively suggest a positive role of PFN1 in BC cell adhesion and tumor growth likely mediated through interactions with fibronectin receptor, endothelin-1, and actin but also alterations in Ca2+ homeostasis, activity of CAMKIV kinase and ultimately changes in CREB and NFkB transcriptional activity. Collectively, loss of PFN1 may lead in alterations of the cytoskeleton re-organisation and Ca2+ homeostasis, disruption of cell adhesion and changes in the extracellular matrix substances, affecting, thus, the initial tumor establishment.

Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστεως αποτελεί δεύτερη σε συχνότητα νεοπλασία του ουρογεννητικού συστήματος. Παράλληλα, οι θεραπευτικές προσεγγίσεις να παραμένουν ελάχιστες. Η χρήση μη επεμβατικών βιοδεικτών και η κατανόηση των υποκείμενων μοριακών διαδικασιών της όγκογένεσης θεωρείται εξαιρετικής σημασίας. Η μελέτη αυτή οδήγησε στην ανάπτυξη δύο πάνελ βιοδεικτών για την διάγνωση πρωτοπαθούς (721 δείγματα ούρων) και υποτροπιάζοντος καρκίνου (636 δείγματα ούρων). Τα δύο διαγνωστικά πάνελ βιοδεικτών περιείχαν 116 και 106 πεπτίδια βιοδείκτες. Ικανοποιητική διαγνωστική ακρίβεια εκτιμήθηκε με βάση τις τιμές AUC σε 0,87 και 0,75, αντίστοιχα. Ο συνδυασμός με την κυτταρολογική εξέταση ούρων αύξησε την τιμή AUC σε 0,87. Παράλληλα διενεργήθηκε μελέτη της Προφιλίνης-1, ως προς το ρόλο της στην προαγωγή του καρκίνου της ουροδόχου κύστεως. Δημιουργήθηκαν γενετικώς τροποποιημένα κύτταρα Τ24Μ με κατάλληλους λεντιϊκούς φορείς, οι οποίοι καταστέλουν την έκφραση της Προφιλίνης-1. Μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης οδήγησε σε μειωμένο πολυμερισμό της Ακτίνης και αναστολή της κυτταρικής κινητικότητας. Παράλληλα, προκάλεσε την αυξημένη παραγωγή γνωστών παραγόντων με δραστικότητα καταστολής όγκων, όπως ο GM-CSF, και την μείωση των επιπέδων πρωτεϊνών που προωθούν τη μετάσταση, όπως ο FGF-1 και η Ενδοθηλίνη-1. Τα αποτελέσματα συλλογικά υποδεικνύουν ένα θετικό ρόλο της Προφιλίνης-1 στην κυτταρική προσκόλληση και την αύξηση των όγκων.