Μιτοχονδριακή στόχευση της ανθρώπινης γλουταμικής αφυδρογονάσης: δομή σινιάλου στόχευσης, λειτουργία και εξέλιξη

Abstract

Glutamate dehydrogenase (GDH), a very abundant mitochondrial matrix enzyme, is present in almost all living organisms. Human GDH exists in two isoforms, hGDH1 and hGDH2, which both have an unusually large mitochondrial targeting signal (MTS) consisting of 53 amino acid residues (N53). Their N53 peptide has the tendency to form two amphipathic α-helices (α1, α2). Here, we characterized the N53 peptides and the evolution of the GDH MTS among organisms. In the first section we have found that the in vitro synthesized hGDHs can be efficiently imported, proteolytically processed and hexamers into isolated yeast mitochondria depending on the TIM23 complex, on the mitochondrial inner membrane potential and on the concentration of divalent metal ions. We observed that the isoform hGDH2 is imported or/and processed faster in mitochondria than hGDH1. We observed that the mutation G35R in hGDH2, that arises from the common polymorphism GLUD2(c.G103A), does not affect its mitochondrial targeting capacity. We studied the N53 peptide in portions and separate from the rest hGDH, in order to understand its properties. We found that the N53 peptides of hGDHs are essential for mitochondrial localization of hGDHs and they are able to target the non-mitochondrial protein DHFR into mitochondria. Additionally, deletion of the α1 helix of hGDH2 abolishes its mitochondrial import. The α1 helix of hGDH2, but not the α2, is sufficient to target the DHFR protein into mitochondria. We found that the fused peptide α1α2, but not the α1 alone, is able to target the mature hGDH2 protein into mitochondria. Our findings are in agreement with experiments in mammalian cell lines with the epitope EGFP from our collaborators at the Neurology Laboratory of the University of Crete. Therefore, we found that the mitochondrial targeting of hGDH2 relies on the synergistic effect of the two α-helical structures, with the first one having the leading role. We found that the net positive charge of the N-terminal part of the N53 of hGDH2 rather than the amphipathicity, the propensity for α-helix formation or the proteolytic removal of the N53 in the mitochondrial matrix, is the main determinant for their mitochondrial import. In the second section, we have studied the evolution of the MTS of GDH among organisms using in silico prediction programs for ~170 distinct GDH proteins. We found that the GDH cleavable MTS first arose in the kingdom of ciliophora and then evolved step by step into highly efficient and substantially complex MTS in mammals, with potential exceptions the GDH in birds and reptiles. Experimentally, studies carried out in collaboration with the Neurology Laboratory showed that the MTS of GDH from T. thermophila, C. elegans, D. melanogaster and X. laevis alone are able to target DHFR and EGFP into mitochondria. However, the MTS of GDH from T. thermophila seems not to be sufficient to target efficiently the mature hGDH2 into mitochondria.

Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH), ένα πολύ άφθονο ένζυμο της μιτοχονδριακής μήτρας, έχει βρεθεί σε όλους σχεδόν τους ζώντες οργανισμούς. Στον άνθρωπο εμφανίζεται με δύο ισομορφές, την hGDH1 και την hGDH2, οι οποίες έχουν ένα ασυνήθιστα μεγάλο σινιάλο μιτοχονδριακής στόχευσης (MTS) αποτελούμενο από 53 αμινοξέα (Ν53). Το Ν53 έχει την τάση σχηματισμού δύο αμφιπαθών α-ελίκων (α1, α2). Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε σκοπό τον χαρακτηρισμό του πεπτιδίου Ν53 των hGDHs και την μελέτη της εξέλιξης του MTS της GDH μεταξύ των οργανισμών.Στο πρώτο τμήμα της διατριβής, βρήκαμε ότι οι in vitro συντιθέμενες hGDHs μπορούν να εισέλθουν, να κοπούν και να σχηματίσουν εξαμερή σε απομονωμένα μιτοχόνδρια σακχαρομύκητα με τρόπο που εξαρτάται από το κανάλι TIM23, το ηλεκτροχημικό δυναμικό της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και τη συγκέντρωση των δισθενών μεταλλικών ιόντων. Bρέθηκε ότι η ισομορφή hGDH2 μπαίνει ή/και αποκόπτεται ταχύτερα στα μιτοχόνδρια από ότι η hGDH1. Με το ερώτημα αν υπάρχουν διαφοροποιήσεις στην μιτοχονδριακή στόχευση στον άνθρωπο λόγω της μεταλλαγής G35R στην hGDH2 που προκύπτει από τον συχνό στον πληθυσμό πολυμορφισμό του γονιδίου GLUD2 c.G103A, μελετήσαμε την επίδρασή της μεταλλαγής αυτής σε μιτοχόνδρια και είδαμε ότι δεν επηρεάζει την είσοδό της hGDH2 στα μιτοχόνδρια σακχαρομύκητα. Μελετήσαμε το πεπτίδιο Ν53 κατά τμήματα και επίσης ξεχωριστά από την υπόλοιπη hGDH, ώστε να κατανοήσουμε της ιδιότητές του. Πειράματα εισόδου σε απομονωμένα μιτοχόνδρια έδειξαν ότι το πεπτίδιο Ν53 είναι απαραίτητο για την μιτοχονδριακή στόχευση των hGDHs και είναι ικανό από μόνο του να οδηγήσει την μη μιτοχονδριακή πρωτεΐνη DHFR στα μιτοχόνδρια. Επίσης, βρέθηκε ότι όταν απουσιάζει η α1 έλικα της hGDH2, η hGDH2 χάνει την ικανότητά της για μιτοχονδριακή στόχευση. Παρατηρήθηκε ότι η α1 της hGDH2, αλλά όχι η α2, μπορεί να οδηγήσει το πεπτίδιο DHFR στα μιτοχόνδρια. Παρατηρήθηκε ότι το συζευγμένο πεπτίδιο α1α2, αλλά όχι το πεπτίδιο α1 από μόνο του, είναι ικανό να οδηγήσει στα μιτοχόνδρια την ώριμη hGDH2. Τα ευρήματά μας είναι σε συμφωνία με πειράματα που έγιναν από τους συνεργάτες μας του Εργαστηρίου Νευρολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών με τον επίτοπο EGFP. Ως εκ τούτου, βρέθηκε ότι η μιτοχονδριακή στόχευση της hGDH2 στηρίζεται στη συνεργατική δράση των δύο α-ελίκων και ότι η α1 έχει πρωταγωνιστικό ρόλο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το ηλεκτρικό φορτίο στο Ν-τελικό άκρο του πεπτιδίου Ν53 της hGDH2 είναι πιο σημαντικό για την μιτοχονδριακή στόχευση της από ότι η αμφιπαθικότητα, η ελικοειδής διαμόρφωση και η πρωτεολυτική αποκοπή του Ν53.Στο δεύτερο τμήμα της διατριβής, μελετήθηκε η εξέλιξη του MTS της GDH μεταξύ των οργανισμών χρησιμοποιώντας in silico προγράμματα πρόβλεψης για ~170 διαφορετικές πρωτεϊνικές αλληλουχίες GDH. Προβλέφθηκε ότι η εμφάνιση ύπαρξης αποκοπτόμενου MTS πιθανώς να ξεκίνησε από τα βλεφαριδοφόρα και να εξελίχθηκε σταδιακά σε ένα πολύ ισχυρό και πολυπλοκότερο σινιάλο MTS στα θηλαστικά, με πιθανή εξαίρεση την GDH στα πτηνά και τα ερπετά. Πειραματικές μελέτες σε συνεργασία με το Εργαστήριο Νευρολογίας έδειξαν ότι τα MTS της GDH των οργανισμών T. thermophila, C. elegans, D. melanogaster και X. laevis είναι ικανά να στοχεύσουν τις πρωτεΐνες DHFR και EGFP στα μιτοχόνδρια. Αντίθετα, βρέθηκε ότι το MTS της T. thermophila αδυνατεί να στοχεύσει αποδοτικά την ώριμη hGDH2 στα μιτοχόνδρια.