Κυτταρική θεραπεία οξείας και χρόνιας ηπατικής βλάβης με χορήγηση κυττάρων μυελού των οστών ή με κινητοποιητές αιμοποιητικών στελεχιαίων κυττάρων

Abstract

The recognized potential of bone marrow (BM) cells to differentiate into a broad spectrum of tissues has emerged intense research interest on their use as possible candidates for cell therapy of acute and chronic liver diseases. Ιt has been reported that bone marrow could serve as a source of cells facilitating liver repopulation in case of hepatic damage both in experimental and clinical studies as well. The aim of the present thesis was to explore the effect of two bone marrow subpopulations, mesenchymal (MSCs) and hematopoietic (HSCs) stem cells in experimental animal models of acute and chronic liver injury. MSCs, MSCs-secreted molecules and their combination, proved effective in ameliorating liver fibrosis by inhibiting the proliferation of myofibroblasts, increasing VEGF concentration and restoring a functional liver vasculature. These effects were accompanied by a change in the expression pattern of proinflammatory cytokines in cirrhotic animals which received treatment.In contrast, MSCs administration in induced acute liver injury did not improve liver’s histology, regardless of the route of administration and the number of infused cells. This may be related to the highly inflammatory microenvironment in acute liver failure, which seems to adversely affect the efficiency of MSCs. In order to investigate HSCs contribution to the restoration of chronic liver injury in CCl4-treated mice, we comparatively tested G-CSF, the most widely used mobilizing agent, Plerixafor, a novel mobilizing agent of HSCs, as well as their combination. Either single-agent mobilization or the combination of agents significantly ameliorated hepatic damage by decreasing fibrosis and restoring the abnormal vascular network in the liver of mobilized mice as compared to CCl4-only mice. The combination of G-CSF+Plerixafor yielded significantly higher numbers of circulating HSCs over other groups, however, the degree of fibrosis reduction was similar among all mobilized mice. The liver homing potential of HSCs differed among the various mobilization approaches. An extended G-CSF treatment provided the highest anti-fibrotic effect of all tested modalities, inducing proliferation of hepatic stem cells and decreasing the hepatic inflammation. Plerixafor, despite the reduced liver homing potential of Plerixafor-mobilized HSCs, reversed fibrosis mainly by increasing hepatic PPAR-γ and VEGF expression. In all groups, BM-derived mature hepatocytes as well as liver-committed BM stem cells were detected only at low frequencies in the liver, implying that the hepatic recovery is regulated by alternative mechanisms, largely independent of the frequency of HSCs in the liver. It is possible that the mobilizing agents per se, exert a direct, non-HSC-dependent, hepatotrofic effect to the liver, contributing independently from or/and in parallel with the HSCs to hepatic reconstitution.Conclusively, the results of this doctoral thesis suggest that both MSCs and their secreted molecules, as well as HSCs mobilization agents, G-CSF, Plerixafor and G-CSF+Plerixafor, provide potent anti-fibrotic effects and contribute to the reconstruction and regeneration of liver parenchyma by acting differentially during the wound healing process.

Η αναγνωρισμένη ιδιότητα των κυττάρων του μυελού των οστών να διαφοροποιούνται «ανορθόδοξα» σε διάφορους κυτταρικούς τύπους έχει εγείρει ελπίδες, ότι η κυτταρική θεραπεία θα μπορούσε να προσφέρει εναλλακτικές θεραπευτικές δυνατότητες για ασθενείς με οξεία και χρόνια ηπατική βλάβη. Υπάρχει πληθώρα βιβλιογραφικών αναφορών, σχετικά με την ικανότητα των κυττάρων του μυελού των οστών να δίνουν γένεση σε ηπατοκύτταρα σε συνθήκες ιστικής καταπόνησης, τόσο σε πειραματόζωα όσο και στον άνθρωπο. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης δύο κυτταρικών πληθυσμών του μυελού των οστών, των μεσεγχυματικών (MSCs) και των αιμοποιητικών (HSCs) στελεχιαίων κυττάρων, σε πειραματικά ζωικά μοντέλα οξείας και χρόνιας ηπατικής βλάβης.Διαπιστώθηκε ότι η χορήγηση MSCs, συμπυκνωμένου υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs (δηλαδή των εκκρινόμενων από τα MSCs διαλυτών παραγόντων), καθώς και του συνδυασμού τους, προκάλεσε σημαντική βελτίωση της χρόνιας ηπατικής βλάβης σε πειραματικό ζωικό μοντέλο ποντικών. Συγκεκριμένα, μείωσε τη συνολική έκταση της ίνωσης, τον αριθμό των ενεργοποιημένων μυοϊνοβλαστών και τα επίπεδα της τρανσαμινάσης της αλανίνης στο αίμα των πειραματόζωων, ενώ παράλληλα συνέβαλε στη λειτουργική νεοαγγείωση του ήπατος μέσω της αύξησης της συγκέντρωσης του VEGF. Επιπρόσθετα, διαπιστώθηκε, τόσο in vitro όσο και in vivo, αλλαγή του προτύπου έκφρασης των προφλεγμονωδών κυτοκινών TNFα και IL-6 στα κιρρωτικά ζώα στα οποία χορηγήθηκε θεραπεία. Αντίθετα, η χορήγηση MSCs σε επίμυες, στους οποίους είχε προκληθεί οξεία ηπατική βλάβη, δεν βελτίωσε την ιστολογική εικόνα του ήπατος, ανεξάρτητα από την οδό χορήγησης αλλά και τον αριθμό των χορηγούμενων κυττάρων. Το γεγονός αυτό σχετίζεται, ενδεχομένως, με το έντονα φλεγμονώδες περιβάλλον της οξείας ηπατικής βλάβης, το οποίο φαίνεται να επηρεάζει την αποδοτικότητα των MSCs.Η συμβολή των HSCs, από την άλλη πλευρά, στην αποκατάσταση της ηπατικής βλάβης μελετήθηκε μέσω της κινητοποίησης των HSCs. Η κινητοποίηση των HSCs με χορήγηση αυξητικών παραγόντων προκαλεί την «εκβιαστική» κυκλοφορία ενός μεγάλου αριθμού στελεχιαίων κυττάρων στο περιφερικό αίμα, μετακινώντας τα από τη φυσική τους θέση, το μυελό των οστών. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε ο ευρέως χρησιμοποιούμενος στην κλινική πράξη αυξητικός παράγοντας των κοκκιοκυττάρων (G-CSF), ένας νέος κινητοποιητής των HSCs, το Plerixafor – η δράση του οποίου δεν έχει διερευνηθεί σε περιπτώσεις ηπατικών βλαβών –, καθώς και συνδυασμός των δύο κινητοποιητών. Και οι τρεις επιλογές κινητοποίησης επέφεραν σημαντική βελτίωση της χρόνιας ηπατικής βλάβης, μειώνοντας την ίνωση και αποκαθιστώντας το κατεστραμμένο αγγειακό δίκτυο των ζώων, στα οποία είχε προκληθεί χρόνια ηπατική βλάβη με χορήγηση CCl4. Αν και ο συνδυασμός G-CSF+Plerixafor αποτέλεσε τον αποδοτικότερο τρόπο κινητοποίησης, αποδίδοντας τον υψηλότερο αριθμό κυκλοφορούντων HSCs, το γεγονός ότι η μείωση της ίνωσης δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των ομάδων στις οποίες χορηγήθηκαν κινητοποιητές, υποδηλώνει πως το μέγεθος της βελτίωσης της ίνωσης δεν είναι ανάλογο της αποτελεσματικότητας της κινητοποίησης των HSCs. Επομένως, άλλοι μηχανισμοί – πιθανά, όχι άμεσα εξαρτώμενοι από τα HSCs – συμβάλλουν στην αναγέννηση του ήπατος. Η αποίκηση του ήπατος από τα κινητοποιημένα HSCs διέφερε ανάλογα με τον τρόπο της κινητοποίησης, με αποτέλεσμα να διαφοροποιείται και η συνεισφορά των κινητοποιημένων κυττάρων στην αποκατάσταση του ήπατος. Τη μεγαλύτερη αντι-ινωτική επίδραση είχε η παρατεταμένη με G-CSF θεραπεία, που συνοδεύτηκε από αυξημένο πολλαπλασιασμό των ωοειδών κυττάρων του ήπατος και μειωμένη ηπατική φλεγμονή. Από την άλλη πλευρά, τα Plerixafor-κινητοποιημένα HSCs συνέβαλλαν στην υποστροφή της ίνωσης αυξάνοντας την ηπατική έκφραση του PPAR-γ, μέσω του οποίου ρυθμίζεται κυρίως η απενεργοποίηση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων, και του VEGF, που συνοδεύτηκε από βελτίωση του μικροαγγειακού δικτύου του ήπατος. Σε όλες τις πειραματικές ομάδες, στις οποίες χορηγήθηκαν κινητοποιητές, τα προερχόμενα από το μυελό των οστών ώριμα ηπατοκύτταρα, καθώς και τα δεσμευμένα προς ηπατική κατεύθυνση στελεχιαία κύτταρα του μυελού των οστών, ανιχνεύθηκαν σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις στο ηπατικό παρέγχυμα, υποστηρίζοντας την εκτίμηση ότι εναλλακτικοί μηχανισμοί, ανεξάρτητοι από την άμεση επίδραση των HSCs ή την ποσοστιαία αναλογία τους στο ήπαρ, ρυθμίζουν την ηπατική αναγέννηση. Είναι πιθανόν, οι κινητοποιητές των HSCs, μέσω άμεσης δράσης τους στο ήπαρ, ανεξάρτητης της κινητοποίησης, να δρουν ως ηπατοτροφικοί παράγοντες και να συντελούν ανεξάρτητα από ή παράλληλα με τα HSCs στην ηπατική αποκατάσταση.Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής προτείνουν πως τόσο τα MSCs και οι εκκρινόμενοι από αυτά διαλυτοί παράγοντες, όσο και οι κινητοποιητές των HSCs – G-CSF, Plerixafor αλλά και ο συνδυασμός G-CSF+Plerixafor –, δρώντας ποικιλοτρόπως και πολυπαραγοντικά κατά τη διάρκεια της επουλωτικής διαδικασίας της χρόνιας ηπατικής βλάβης, παρέχουν τελικά ένα ισχυρό αντι-ινωτικό αποτέλεσμα συμβάλλοντας στην αναδόμηση και αναγέννηση του ηπατικού παρεγχύματος.