Study of the transcriptional regulation of α-synuclein

Abstract

α-synuclein is a small presynaptic neuronal protein, encoded by the SNCA gene, that is implicated genetically and neuropathologically in Parkinson’s disease (PD). A large body of evidence has established that PD pathogenesis is closely linked to increased levels of SNCA; however to date, the biochemical pathways and transcriptional elements that control SNCA expression are still obscure. Previous experiments in our laboratory in the PC12 cell line demonstrated that the transcription factor ZSCAN21 binds to the intron 1 region of the Snca gene and is strongly involved in its transcriptional regulation. Therefore, in the current experiments, we wished to characterize further the role of ZSCAN21 in Snca transcriptional regulation in primary cultures and in vivo. We find that in vivo ZSCAN21 is expressed in neurons and its levels are developmentally regulated in different brain regions where ASYN is also detected. Further, we confirmed through Chromatin Immunoprecipitation its presence in a binding complex in the intron 1 region of the Snca gene in rat cortical neuronal cultures. Importantly, lentiviral-mediated silencing of Zscan21 increased significantly the promoter activity of Snca as well as its mRNA and protein levels in such cultures. In contrast, Zscan21 mediated silencing in differentiated neurosphere cultures reduced Snca levels. Stereotaxic delivery of adeno-associated virus against Zscan21 in the postnatal and adult hippocampus, an area linked with the non-motor symptoms of PD, revealed no significant alterations in Snca levels, despite efficient Zscan21 knock-down. Interestingly, Zscan21 overexpression in cortical neurons with adenoviruses led to robust mRNA but negligible protein expression, suggesting that ZSCAN21 protein levels are tightly regulated post-transcriptionally and / or post-translationally. Therefore, overall, our study demonstrates that ZSCAN21, a transcription factor whose levels are under strict posttranscriptional / posttranslational control in neurons, is diversely implicated in the transcriptional regulation of Snca in respect to the developmental stage, at least in in vitro primary neuronal settings. In vivo, however, the unaltered Snca levels observed following Zscan21 downregulation, imply the presence of alternative or perhaps compensatory mechanisms that regulate Snca transcription in such settings. Furthermore, in a genetic case control study of the ZSCAN21 binding site in SNCA intron 1, we did not find polymorphisms between PD patients and controls, suggesting that genetic diversity within this region does not contribute to disease pathogenesis. Overall, given the diverse effects in cell culture, and the lack of discernible in vivo effects, and although further studies are needed, our work does not provide sufficient support for the idea of targeting ZSCAN21 in order to manipulate SNCA levels in synucleinopathy models.

Η νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) αποτελεί μια χρόνια νευροεκφυλιστική νόσο με άγνωστη μέχρι σήμερα αιτιολογική θεραπεία. Ένα από τα σημαντικότερα γονίδια που εμπλέκονται στη παθολογία της ΝΠ είναι η α-συνουκλεΐνη (SNCA), η οποία κωδικοποιεί για μια μικρή, νευρωνική, προσυναπτική πρωτεΐνη. Πλήθος μελετών υποστηρίζουν ότι η υπερέκφραση της SNCA οδηγεί σε φαινότυπους που προσομοιάζουν με τη ΝΠ σε διάφορα κυτταρικά και ζωικά μοντέλα. Παρόλα αυτά τα βιοχημικά μονοπάτια καθώς και τα ρυθμιστικά στοιχεία που ελέγχουν τα επίπεδα έκφρασής της παραμένουν σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστα. Προηγούμενα πειράματα στο εργαστήριο μας, στην κυτταρική σειρά PC12, έχουν δείξει ότι ο μεταγραφικός παράγοντας ZSCAN21 προσδένεται στη ρυθμιστική περιοχή του πρώτου εσωνίου της Snca και συμμετέχει ενεργά στη μεταγραφική της ρύθμιση. Βασιζόμενοι σε αυτό το εύρημα, στη παρούσα μελέτη διερευνήσαμε περαιτέρω τη δράση του ZSCAN21 στη ρύθμιση των επιπέδων της Snca σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων καθώς και σε εγκεφάλους από επίμυες in vivo. Διαπιστώσαμε τη νευρωνική έκφραση του ZSCAN21 καθώς και τη διαφορική του ρύθμιση σε διακριτά αναπτυξιακά στάδια σε περιοχές του εγκεφάλου (από επίμυ) όπου εντοπίζεται και η ASYN. Επιπλέον, μέσω πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (CHIP), επιβεβαιώσαμε τη συμμετοχή του ZSCAN21 στο ρυθμιστικό σύμπλοκο-πρόσδεσης στη περιοχή του πρώτου εσωνίου της Snca σε καλλιέργειες φλοιού από επίμυ. Στοχευμένη σίγαση της έκφρασης του Zscan21 σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων μέσω λεντι-ιών οδήγησε σε σημαντική αύξηση της Snca τόσο σε επίπεδο ενεργότητας του υποκινητή της όσο και σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. Αντίθετα, σίγαση του Zscan21 σε καλλιέργειες νευρικών βλαστικών κυττάρων (νευροσφαιρών, neurosphere cultures) είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων της Snca. Στερεοταξική έγχυση αδενοσχετιζόμενων ιών (AAVs) έναντι του Zscan21 σε μετεμβρυϊκούς (postnatal) και ενήλικες επίμυες στην περιοχή του ιππόκαμπου, η οποία συνδέεται κύρια με τα μη κινητικά συμπτώματα της ΝΠ, δε μετέβαλε σημαντικά τα επίπεδα της Snca. Πειράματα υπερέκφρασης του Zscan21 σε πρωτογενείς φλοιϊκές καλλιέργειες από επίμυ μέσω αδενο-ιών (AVs) δεν αύξησαν σημαντικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης του ZSCAN21, παρά τη σημαντική αύξηση στο επίπεδο του mRNA του Zscan21, υποδηλώνοντας ότι τα επίπεδα του ZSCAN21 πρέπει να υπόκεινται σε αυστηρό μετα-μεταγραφικό ή / και μετα-μεταφραστικό έλεγχο. Λαμβάνοντας υπόψιν τα παραπάνω αποτελέσματα διαπιστώνεται ότι ο ZSCAN21, ένας μεταγραφικός παράγοντας του οποίου τα πρωτεϊνικά επίπεδα ρυθμίζονται αυστηρά, εμπλέκεται ποικιλοτρόπως στη μεταγραφική ρύθμιση της Snca ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο, τουλάχιστον στα in vitro συστήματα πρωτογενών καλλιεργειών που μελετήσαμε. Παρόλα αυτά, το γεγονός ότι δε παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα της Snca έπειτα από σίγαση του Zscan21 σε επίμυες ιn vivo, υποδηλώνει τη παρουσία αντιρροπιστικών μηχανισμών που συμμετέχουν στη ρύθμιση της. Επιπλέον, ανάλυση δειγμάτων ασθενών με ΝΠ και ατόμων ελέγχου, σχετικά με την εύρεση πιθανών πολυμορφισμών τόσο στη θέση πρόσδεσης του ZSCAN21 όσο και στο ευρύτερο τμήμα στη περιοχής του πρώτου εσωνίου της SNCA που περιέχει επιπλέον ρυθμιστικά στοιχεία δεν αποκάλυψε σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η γενετική πολυμορφία μέσα στη συγκεκριμένη περιοχή δε φαίνεται να συνεισφέρει στη παθογένεια της νόσου. Συνολικά, η πολυπλοκότητα της δράσης του ZSCAN21 στη ρύθμιση της Snca σε διαφορετικά συστήματα πρωτογενών καλλιεργειών νευρώνων, σε συνδυασμό με την απουσία επίδρασης του ZSCAN21 στα επίπεδα της SNCA στα in vivo πειράματα, συνηγορούν στο ότι η στόχευση του ZSCAN21 ως πιθανό θεραπευτικό μέσο δε φαίνεται να αποτελεί τη κατάλληλη επιλογή για τη ρύθμιση των επιπέδων της SNCA.