Πρωτεομική ανάλυση για την ανίχνευση βιοδεικτών στις φλεγμονώδεις νόσους του εντέρου

Abstract

ObjectiveAim of this thesis was to reveale biomarkers to understand the pathogenesis, early diagnosis and response to IFX. For this purpose, differential expression of proteins in serum of children and adults with Crohn’s disease (CD) was measured, using proteomic techniques. The adult group included subjects treated with IFX and divided into three groups according to clinical and serological response to therapy. Materials & MethodsSerum samples from adults and children with active CD and adults who either had achieved clinical and serological remission (Rm), or response (Rs) and/or were primary non responders (PNRs) to IFX were subjected to two-dimensional Gel Electrophoresis. Following relative quantitation of protein spots exhibiting differential expression among the groups by densitometry, and further characterization by MALDI-TOF-MS. Results were further confirmed by Western blot analysis.ResultsClusterin (CLUS) was found to be significantly expressed in adults, whereas the Ceruloplasmin (CERU) and Apolipoprotein B-100 (APOB) were found to be significantly over-expressed in children population indicating that those expressions might be implicated on the onset or progression of CD. In the PNR and Rs groups, apolipoprotein A-I (APOΑ1), apolipoprotein E (APOE), complement C4-B (CO4B), plasminogen (PLMN), serotransferrin (TRFE), beta-2-glycoprotein 1 (APOH), and clusterin (CLUS) were found to be up-regulated, whereas their levels displayed no changes in the Rm group when compared to baseline samples. Additionally, leucine-rich alpha-2-glycoprotein (A2GL), vitamin D-binding protein (VTDB), alpha-1B-glycoprotein (A1BG) and complement C1r subcomponent (C1R) were significantly increased in the serum of the Rm group. ResultsThrough the incorporation of proteomics technologies, novel serum marker-molecules demonstrating high sensitivity and specificity are introduced, hence offering an innovative approach regarding the evaluation of CD patients’ response to IFX therapy and early onset of disease.

ΣτόχοςΣτόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάδειξη βιοδεικτών για την κατανόηση της αιτιοπαθογένειας, για την πρώιμη διάγνωση και την απόκριση στο IFX. Για το σκοπό αυτό, μετρήθηκε η διαφορική έκφραση πρωτεϊνών του ορού παιδιών και ενηλίκων με νόσο του Crohn (CD), χρησιμοποιώντας πρωτεομικές τεχνικές. Η ομάδα των ενηλίκων περιλάμβανε άτομα στα οποία χορηγήθηκε IFX και χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες, ανάλογα με την κλινική και ορολογική τους απόκριση στη θεραπεία. Υλικά & ΜέθοδοιΔείγματα ορού από ενήλικες και παιδιά με ενεργή CD και ενήλικες που είχαν κλινική και ορολογική ύφεση (Rm), ή απόκριση (Rs) ή δεν αποκρίθηκαν αρχικά (PNRs) στο IFX, διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων. Μετά τη σχετική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών κηλίδων που παρουσίαζαν διαφορική έκφραση μεταξύ των ομάδων μέσω πυκνομέτρησης, ακολούθησε περαιτέρω χαρακτηρισμός με MALDI-TOF-MS. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με Western blot.ΑποτελέσματαΗ σύγκριση των διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών στα παιδιά και στους ενήλικες έδειξε ότι η κλαστερίνη (CLUS) εκφραζόταν σημαντικά στους ενήλικες, ενώ η σερουλοπλασμίνη (CERU) και η απολιποπρωτεΐνη B-100 (APOB) υπερεκφράζονται σημαντικά στα παιδιά, δείχνοντας ότι αυτές οι εκφράσεις μπορεί να εμπλέκονται στην πρώιμη έναρξη ή εξέλιξη της CD. Στις ομάδες PNR και Rs, η απολιποπρωτεϊνη A-I (APOΑ1), η απολιποπρωτεϊνη E (APOE), το συμπλήρωμα C4-B (CO4B), το πλασμινογόνο (PLMN), η σεροτρανσφερίνη (TRFE), η β-2-γλυκοπρωτεΐνη 1 (APOH), και η κλαστερίνη (CLUS) βρέθηκαν να υπερεκφράζονται, ενώ τα επίπεδα τους δεν παρουσίαζαν αλλαγές στην ομάδα Rm όταν συγκρίθηκαν με τις τιμές πριν τη θεραπεία. Επιπλέον, η άλφα-2-γλυκοπρωτεΐνη πλούσια σε λευκίνη (A2GL), η βιταμίνη D-συνδεόμενη πρωτεΐνη (VTDB), η άλφα-1B-γλυκοπρωτεΐνη (A1BG) και η C1r υπομονάδα του συμπληρώματος (C1R) ήταν σημαντικά αυξημένες στον ορό της ομάδας Rm. ΣυμπεράσματαΜε τη χρήση των πρωτεομικών τεχνικών, εισάγονται νέοι μοριακοί δείκτες οι οποίοι παρουσίασαν υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, ως εκ τούτου, προσφέρεται μια καινοτόμος προσέγγιση όσον αφορά την αξιολόγηση της απόκρισης στη θεραπεία με IFX και της πρώιμης έναρξης της νόσου.