Ο ρόλος των ενδοκυττάριων σηματοδοτικών μηχανισμών σε ασθενείς με ιογενείς ηπατίτιδες

Abstract

Innate and adaptive immune responses against HBV have been shown to play a pivotal role in the control of viral replication as well as in the causation of liver damage. Studies in transgenic mice and human cell lines have shown that during HBV infection several intracellular signaling pathways, including p38 MAPK, are involved in cytokine production and T-cell differentiation.The aim of this study was to investigate the role of p38 MAPK signaling pathway in different phases of the natural history of chronic HBV infection. Thirteen patients with chronic HBV infection were studied. Ten patients had chronic active hepatitis and 3 were inactive carriers of HBV. Patients with chronic active hepatitis were studied before antiviral treatment and at the time of virological response (5 were treated with nucleos(t)ide analogues (NA) and 5 were treated with Peg-IFN-a). Three healthy individuals were studied as controls. Cryopreserved peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were used to determine: a) phosphorylation of p38 MAPK (p-p38) in PBMCs by flow cytometry after incubation with arsenite, PMA and ionomycin and combination of rhIL-12 + rhIL-2 and rhIL-12 + rhIL-18 for 30, 60, 120 and 240 min and b) IFN-γ production from PBMCs after culture with rhIL-12 + rhIL-2 and rhIL-12 + rhIL-18 in the presence or absence of the p38 MAPK inhibitor, SB203580 with ELISA and ELISpot. Also expression of intracellular IFN-γ was estimated by flow cytometry after incubation with PMA and ionomycin. Both patients with active hepatitis B and inactive carriers had significantly higher percentages of p-p38 MAPK positive PBMCs compared to healthy donors. Inactive carriers had the highest percentages of p-p38 positive PBMCs amongst the 3 groups. Patients receiving NA and 2 out of the 5 patients treated with PEG-IFN-a demonstrated reduced percentages of p-p38 MAPK positive PBMCs at the time of virological response compared to those observed before treatment. Similar results were obtained in PBMCs and T -cell subpopulations, especially in CD3+ (T cells) and CD56- (non-NK cells) independent of the stimulus used.Patients with chronic hepatitis B had higher IFN-γ concentrations compared to healthy controls as demonstrated both in ELISA and ELISpot experiments. Similarly, intracellular IFN-γ expression assessed by flow cytometry was higher in patients with active hepatitis B infection compared to healthy controls. Chronic hepatitis B patients tended to have higher IFN-γ concentrations at the time of virological response compared to those observed before treatment. Pharmacological Inhibition of p38 MAPK with SB203580 resulted in reduction of IFN-γ production at all time points in all studied groups. These findings indicate that IFN-γ production/expression correlates with activation of the p38 MAPK intracellular signaling pathway in patients with chronic hepatitis B virus infection. In conclusion, our study demonstrates for the first time the pivotal role of p38 MAPK signaling pathway in the immune responses during chronic HBV infection.

Η εγγενής και η ειδική ανοσιακή απάντηση έναντι του HBV έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του ιικού πολλαπλασιασμού και στην παθογένεια της ηπατικής βλάβης. Μελέτες σε διαγονιδιακά ποντίκια και κυτταρικές σειρές έδειξαν ότι στην HBV λοίμωξη ενεργοποιούνται αρκετοί ενδοκυττάριοι σηματοδοτικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην παραγωγή κυτταροκινών και τη διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένου αυτού της p38 MAPK. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της συμβολής της ενδοκυττάριας οδού της p38 MAPK σε διάφορα στάδια της χρόνιας HBV λοίμωξης. Mελετήθηκαν 10 ασθενείς με χρόνια ενεργό HBV λοίμωξη στις φάσεις της ιαιμίας και της ανταπόκρισης στην αγωγή (5 έλαβαν νουκλεοσ(τ)ιδικά ανάλογα (ΝΑ) και οι υπόλοιποι έλαβαν PEG-IFN-2a), 3 ανενεργοί φορείς του HBV και 3 υγιείς μάρτυρες. Συγκεκριμένα, στα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMCs) και σε Τ κυτταρικούς υποπληθυσμοούς (CD3+, CD3-, CD56+, CD56-) των ανωτέρω υπό μελέτη ομάδων προσδιορίσθηκαν: α) η ενεργοποίηση της p38 MAPK στα PBMCs με τη τεχνική της κυτταρομετρίας ροής μετά την καλλιέργεια των κυττάρων με τους μη ειδικούς διεγέρτες arsenite, PMA και ionomycin, rIL-12 και rIL-18, rIL-12 και rIL-2 σε τέσσερις χρονικές στιγμές επώασης (30’, 60’, 120’, 240’), β) η παραγωγή IFN-γ μετά επώαση των PBMCs με τους συνδυασμούς των rIL-12 με rIL-18 και rIL-12 με rIL-2 με ή χωρίς την παρουσία του ειδικού αναστολέα της p38 MAPK, SB203580, με τις τεχνικές της ELISA και της ELISpot. Παράλληλα μελετήθηκε η ενδοκυττάρια έκφραση της IFN-γ με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής μετά διέγερση με PMA και ionomycin. Οι ασθενείς με χρόνια ενεργό ηπατίτιδα Β στη φάση της ιαιμίας εμφάνιζαν υψηλότερα ποσοστά ενεργοποιήσης της p38 MAPK στα PBMCs σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Οι ανενεργοί φορείς της νόσου εμφάνιζαν τα υψηλότερα ποσοστά και από τις τρεις ομάδες. Κατά τη φάση της ανταπόκρισης στην αντι-ιική αγωγή, οι ασθενείς που έλαβαν ΝΑ και 2 από τους ασθενείς που έλαβαν PEG-IFN-a παρουσίαζαν μείωση των ποσοστών ενεργοποίησης της p38 MAPK σε σχέση με αυτά στη φάση της ιαιμίας. Οι εν λόγω διαφορές αφορούσαν τόσο το σύνολο των PBMCs όσο και στους κυτταρικούς Τ υποπληθυσμούς και ιδιαίτερα στα CD3+ (T λεμφοκύτταρα) και στα CD56- (non-NK cells) σε όλες τις επιμέρους συνθήκες, δηλαδή όλους τους διεγέρτες και στις τέσσερις χρονικές στιγμές επώασης. Με τις τεχνικές ELISA και ELISpot διαπιστώθηκε ότι οι ασθενείς με χρόνια HBV λοίμωξη εμφάνιζαν μεγαλύτερη παραγωγή IFN-γ σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Ανάλογα ήταν και τα αποτελέσματα που αφορούσαν στην ενδοκυττάρια έκφραση IFN-γ με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Στη φάση της ιολογικής ανταπόκρισης στην αντι-ιική αγωγή, οι ασθενείς με ενεργό HBV λοίμωξη εμφάνιζαν τάση αύξησης της παραγόμενης IFN-γ. Η επώαση των PBMCs με τον αναστολέα της p38 MAPK οδήγησε στη μείωση της παραγωγής ΙFN-γ σε όλες της συνθήκες μελέτης, γεγονός που υποδεικνύει ότι η παραγωγή/έκφραση IFN-γ φαίνεται να σχετίζεται με την ενεργοποίηση της σηματοδοτικής οδού της p38 MAPK στη χρόνια ηπατίτιδα Β. Συμπερασματικά, η μελέτη μας δείχνει για πρώτη φορά τον σημαίνοντα ρόλο της p38 MAPK στην ανοσιακή απόκριση σε ασθενείς με χρόνια HBV λοίμωξη.