Μελέτη ανόργανων συστατικών οστών με φασματοσκοπικές τεχνικές

Abstract

The aim of this thesis is the study of the main two bone minerals, calcium (Ca) and phosphorus (P), in order to calculate the Ca/P ratio. According to the literature this ratio is the most reliable parameter for understanding the changes in bones brought about by age, gender and skeletal irregularities. Moreover, this thesis introduces Auger spectroscopy as a technique for the determination of Ca/P ratio. This ratio is also studied by X-ray spectroscopy facilitated on a Scanning Electron Microscope (SEM). The Auger spectra are generated by electrons emitted from the surface of a material. The elemental analysis of SEM is based on the emitted X-rays from the material. The peaks of both spectrums are characteristics of each chemical component of the material. Both techniques are suitable for the measurement of skeletal Ca/P ratio. Biopsies from three different animals were studied: mice, rats and rabbits. Samples were taken from both sides of the skeleton (right, left) from cortical bones (femur, rear and front tibias) and trabecular (ribs) in an effort to assess if the bone position and kind affect the Ca/P ratio. Furthermore, the possible role of age and gender on the ratio, was studied. Biopsies from rabbits (male, female) of cortical and trabecular bones were also studied. Samples from normal female rabbits were compared with osteoporotic ones. Osteoporosis was induced by the method IMO (Inflammation Mediated Osteoporosis). Finally, an overall comparison of Ca/P ratios from the three kinds of animals was performed in order to examine the dependence of the animal kind on the ratio. The results of this thesis show that the Ca/P ratio is influenced neither by the side of animal nor by gender (male, female). The Ca/P ratio depends on the bone site and kind as well as on the specific function of each bone site. In osteoporotic samples, the ratio decreases in cortical bones while no changes appear in trabecular bones. This thesis: a) introduces the Auger spectroscopy for the Ca/P ratio measurement, b) offers future perspective in the study of biomaterials through the Auger spectroscopy and c) contributes to the study and understanding of the bone composition related to osteoporosis which comprises a continues research field. The results of the present thesis demonstrate that the Auger spectroscopy is suitable for the accurate measurement of Ca/P ratio in experimental animal bones. Although it is a biological bone study rather than a clinical study for immediate application to patients, may be useful to medical doctors who follow up such patients and participate either in the diagnosis or treatment of such diseases.

Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη των δύο βασικών ανόργανων συστατικών των οστών, ασβεστίου (Ca) και φωσφόρου (P), με σκοπό τον υπολογισμό του λόγου Ca/P. Σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία ο λόγος αυτός είναι η πιο αξιόπιστη παράμετρος για να κατανοηθούν οι αλλαγές στα οστά με βάση την ηλικία, το φύλο και τις σκελετικές ανωμαλίες λόγω παθήσεων. Επίσης, γίνεται η εισαγωγή της φασματοσκοπίας Auger ως τεχνικής για τον προσδιορισμό του λόγου Ca/P ο οποίος παράλληλα μελετάται και μέσω της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης με χρήση στοιχειακού αναλυτή ακτίνων-Χ. Τα φάσματα Auger δημιουργούνται από ηλεκτρόνια που εκπέμπονται από την επιφάνεια ενός υλικού. Οι κορυφές των φασμάτων είναι χαρακτηριστικές του κάθε χημικού στοιχείου της επιφάνειας. Η στοιχειακή ανάλυση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης στηρίζεται στα φάσματα που δημιουργούνται από την εκπομπή χαρακτηριστικών ακτίνων-Χ από το υλικό. Όπως στα φάσματα Auger, έτσι και στα φάσματα των ακτίνων-Χ, οι κορυφές είναι χαρακτηριστικές των στοιχείων του υλικού. Με τις δύο αυτές τεχνικές γίνεται πλήρης ταυτοποίηση του λόγου Ca/P των οστών. Στα πλαίσια αυτά μελετώνται βιοψίες από τρία είδη πειραματοζώων: μύες, επίμυες και κόνικλοι. Τα δείγματα λαμβάνονται από τα δύο μέρη του σκελετού (δεξί, αριστερό) και είναι συμπαγή (κνήμη, μηρός, βραχιόνιο) και σπογγώδη (πλευρά). Έτσι, εξετάζεται κατά πόσο η σκελετική θέση και το είδος του οστού διαμορφώνει το λόγο Ca/P. Επιπλέον, εξετάζονται στους μύες και τους επίμυες τα αντίστοιχα οστά δύο διαφορετικών ηλικιών ώστε να εξαχθεί συμπέρασμα ως προς τη διαφοροποίηση ή μη του λόγου ανάλογα με την ηλικία. Στους κονίκλους (αρσενικά, θηλυκά) μελετώνται βιοψίες συμπαγών και σπογγωδών οστών, όπως και παραπάνω. Εξετάζεται κατά πόσο ο λόγος Ca/P έχει εξάρτηση από τη σκελετική θέση του οστού και το φύλο. Οι θηλυκοί κόνικλοι αποτελούν τους μάρτυρες για τη σύγκριση με τους οστεοπορωτικούς κονίκλους. Η τεχνητή οστεοπόρωση προκαλείται σε μια ομάδα θηλυκών κονίκλων μέσω φλεγμονώδους αντίδρασης (Inflammation Mediated Osteoporosis, IMO). Από τη σύγκριση των βιοψιών οστών τόσο των φυσιολογικών όσο και των οστεοπορωτικών κονίκλων μελετάται κατά πόσο ο λόγος Ca/P επηρεάζεται από την πάθηση. Τέλος, πραγματοποιείται γενική σύγκριση των λόγων Ca/P (αντίστοιχων οστών) και των τριών ειδών πειραματοζώων με σκοπό να εξεταστεί κατά πόσο το είδος του πειραματοζώου παίζει ρόλο στη διαμόρφωση του λόγου. Από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι ο λόγος Ca/P δεν επηρεάζεται ούτε από το μέρος του ζώου (δεξί, αριστερό) ούτε από το φύλο (αρσενικό, θηλυκό). Εξαρτάται από το είδος του οστού (συμπαγές, σπογγώδες) και διαμορφώνεται μικρότερος στα σπογγώδη οστά. Με την πάροδο της ηλικίας, στους επίμυες, ο λόγος διαμορφώνεται μικρότερος, στα βραχιόνια και στις κνήμες. Αντίθετα στους μύες ο λόγος δεν αλλάζει με την ηλικία. Ακόμα, παρατηρήθηκε ότι ο λόγος Ca/P εξαρτάται από το είδος του ζώου και διαμορφώνεται ανάλογα με τη λειτουργία του κάθε οστού. Η οστεοπόρωση, έχει συνέπειες στα συμπαγή οστά (με βάση το λόγο Ca/P), ενώ στα σπογγώδη οστά η νόσος δεν φαίνεται να έχει αντίκτυπο. Η συνεισφορά της παρούσας διδακτορικής διατριβής εντοπίζεται στα εξής σημεία: α) στην εισαγωγή της φασματοσκοπίας Auger για τον προσδιορισμό του λόγου Ca/P στα οστά, β) στη μελλοντική δυνατότητα μελέτης των βιοϋλικών μέσω της φασματοσκοπίας Auger ως επιφανειακή τεχνική και γ) στη μελέτη και κατανόηση της σύστασης των οστών και της νόσου της οστεοπόρωσης που αποτελούν διαχρονικό πεδίο έρευνας. Η παρούσα διατριβή παρουσιάζει εμπεριστατωμένα αποτελέσματα τα οποία αποδεικνύουν ότι η φασματοσκοπία Auger μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αξιόπιστη μέτρηση του λόγου Ca/P σε οστά πειραματοζώων. Αν και η παρούσα εργασία έγινε σε βιολογικά οστά και δεν έγινε σε ασθενείς, μπορεί να είναι χρήσιμη σε ιατρούς οι οποίοι παρακολουθούν ασθενείς και συμμετέχουν στη διάγνωση και θεραπεία σκελετικών παθήσεων.