Μελέτη πρωτεϊνών δικτύων ρύθμισης τα οποία εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο και στην απόπτωση στα διάχυτα λεμφώματα από μεγάλα β-κύτταρα

Abstract

The Jun family includes c-Jun, JunB and JunD that are components of the activator protein-1 (AP-1) transcription factor complex involved in cell proliferation and apoptosis. Recent evidence suggests that c-Jun and JunB are expressed in classical Hodgkin lymphomas and CD30-positive non-Hodgkin lymphomas. The STAT family are important transcription factors that have been implicated in cell differentiation, cycle and death. STAT can be activated via the JAK-STAT pathway. Therefore, the immunohistochemical expression of Jun family proteins was studied in relation to: 1) the CD30 expression, 2) the proliferation profile (cyclin A, B1, D2, D3, E and Ki-67) and 3) B cell differentiation markers (CD10, Bcl-6, MUM-1/IRF4) and phenotype in 130 de novo DLBCL. In a subset of cases with low JunB expression, we performed MSP (methylation specific PCR) in order to investigate whether methylation of the JunB promoter correlates with silencing of the gene. Expression of phospho(ph)-c-Jun, JunB, JunD and ph-STAT3 was found in 59/103 (67%), 100/103 (97%), 94/98 (97%) and 41/61 (67%) cases of DLBCL, respectively. The expression of JunB was positively associated with Ki-67 (p=0.032), cyclin A (p=0.042), cyclin B1 (p=0.016), cyclin D2 (p=0.037), cyclin E (p=0.001), CD30 (p<0.001), MUM-1/IRF-4 (p<0.001) and non-GC phenotype (p=0.006) and negatively with CD10 (p<0.001). Moreover, the expression of JunD was positively associated with Ki-67 (p=0.01), cyclin E (p=0.007) and Bcl-6 (p=0.03) as well as the expression of ph-c-Jun with MUM-1/IRF-4 (p=0.03). Cases were also assigned to a high (52 cases) and a low (77 cases) proliferation cluster by K-means clustering based on the combined expression levels of the proteins Ki-67 and cyclin A, B1, D2, D3 and E. These classification variables were ordered by ANOVA according to their statistically significant contribution to the derived clustering from highest to lowest, as follows: Ki-67, cyclin A, cyclin D3, cyclin E and cyclin B1. Cyclin D2 was the only classification variable with statistically non-significant separation ability. Analysis of the differences in mean values between the two clusters by T-tests, showed significantly higher expression levels of the Ki-67, cyclin A, cyclin B1, cyclin D3, cyclin E, bcl6 (all p<0.001), JunB (p=0.033), JunD (p=0.027) and MUM-1/IRF-4 (p=0.006) in the high expression cluster. Methylation of the JunB promoter was found in 17/20 of the cases with low JunB expression. The proteins of Jun family expressed in DLBCL. The association between JunB and JunD and high proliferation cluster in DLBCL, suggests that increased JunB and JunD expression may be involved in their pathogenesis by favoring tumor cell proliferation. The association between JunB and non-GC phenotype may reflect NFκB control of JunB in view of previous findings that JunB is under NFκB control in classical Hodgkin lymphomas and NFκB is activated in non-GC DLBCL. The association between JunD and Bcl-6 expression is in line with data that JunD is a major enhancer molecule of Bcl-6 in mouse GC B-cells. Aberrant methylation of the JunB promoter may be the underlying mechanism in the cases with low JunB expression.

Η οικογένεια των πρωτεϊνών Jun που περιλαμβάνει τους μεταγραφικούς παράγοντες c-Jun, JunB και JunD, αποτελεί μέλος του συμπλέγματος του μεταγραφικού παράγοντα της ενεργοποιητικής πρωτεΐνης-1 (AP-1, activator protein-1) και εμπλέκεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην απόπτωση. Αποτελέσματα μελετών έδειξαν ότι οι πρωτεΐνες c-Jun και JunB εκφράζονται στο κλασικό Hodgkin λέμφωμα και σε CD30-θετικά μη-Hodgkin λεμφώματα. Η οικογένεια των πρωτεϊνών STAT είναι σημαντικοί μεταγραφικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην κυτταρική διαφοροποίηση, στον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. Η οικογένεια STAT ενεργοποιείται μέσω του JAK/STAT μονοπατιού μεταγωγής σήματος. Μελέτη της έκφρασης της οικογένειας των πρωτεϊνών Jun και ph-STAT3 σε DLBCL δεν έχει δημοσιευθεί στη διεθνή βιβλιογραφία, από όσο τουλάχιστον γνωρίζουμε.Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης των πρωτεϊνών ph(phospho)-c-Jun, JunB, JunD και ph-STAT3 σε 130 περιπτώσεις διάχυτων Β-λεμφωμάτων από μεγάλα κύτταρα (DLBCL, Diffuse Large B-Cell Lymphoma) σε σχέση με: 1) την ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης ενεργοποίησης CD30, 2) το πρότυπο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (κυκλίνες A, B1, D2, D3 και E και Ki-67), 3) την ανοσοϊστοχημική έκφραση πρωτεϊνών Β-κυτταρικής διαφοροποίησης (CD10, Bcl-6 και MUM-1/IRF4) και 4) τους ιστογενετικούς/ανοσοφαινοτυπικούς υπότυπους [ομοιάζοντος με αυτόν των Β-κυττάρων του βλαστικού κέντρου (Germinal Center, GC) και του μη ομοιάζοντος (non-GC)], όπως αυτοί καθορίζονται από την έκφραση των πρωτεϊνών Β-κυτταρικής διαφοροποίησης. Σε ορισμένες περιπτώσεις με χαμηλά και υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης JunB πραγματοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ειδικής της μεθυλίωσης (MSP, methylation specific PCR), με σκοπό να διερευνηθεί εάν η μεθυλίωση του εκκινητή του γονιδίου JunB σχετίζεται με σιγή του γονιδίου.Στην παρούσα μελέτη έκφραση των πρωτεϊνών ph-c-Jun, JunB, JunD και ph-STAT3 ανιχνεύθηκε στις 59/103 (67%), 100/103 (97%), 94/98 (97%) και 41/61 (67%) περιπτώσεις DLBCL, αντίστοιχα. Η έκφραση της JunB συσχετίστηκε θετικά με την έκφραση των πρωτεϊνών Ki-67 (p=0.032), κυκλίνης A (p=0.042), κυκλίνης B1 (p=0.016), κυκλίνης D2 (p=0.037), κυκλίνης E (p=0.001), CD30 (p<0.001) και MUM-1/IRF-4 (p<0.001), καθώς και με τον non-GC ιστογενετικό ανοσοφαινότυπο (p=0.006) και αρνητικά με την έκφραση της πρωτεΐνης CD10 (p<0.001). Η έκφραση της JunD συσχετίστηκε θετικά με την Ki-67 (p=0.01), την κυκλίνη E (p=0.007) και την Bcl-6 (p=0.03) και η ph-c-Jun θετικά με την MUM-1/IRF-4 (p=0.03). Μεθυλίωση του JunB εκκινητή ανιχνεύτηκε σε 17 από τις 20 περιπτώσεις με χαμηλή ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης JunB που εξετάσθηκαν.Οι περιπτώσεις των DLBCL διαχωρίστηκαν σε συστάδες (cluster) υψηλού (52 περιπτώσεις) και χαμηλού (77 περιπτώσεις) κυτταρικού πολλαπλασιασμού με την μέθοδο k-μέσων τιμών συστάδων (k-means clustering), βάσει των επιπέδων συνδυασμένης έκφρασης των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου Ki-67 και των κυκλινών A, B1, D2, D3 και E. Επιπρόσθετα, οι πρωτεΐνες αυτές ιεραρχήθηκαν με τη δοκιμασία ANOVA σύμφωνα με τη συμβολή της καθεμιάς στο διαχωρισμό των περιπτώσεων των DLBCL σε συστάδες υψηλού και χαμηλού κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η σειρά της στατιστικής σημαντικής ικανότητας διαχωρισμού των πρωτεϊνών αυτών ήταν: Ki-67, κυκλίνη A, κυκλίνη D3, κυκλίνη E και κυκλίνη B1. H κυκλίνη D2 ήταν η μόνη πρωτεΐνη ταξινόμησης που δεν παρουσίασε στατιστικώς σημαντική ικανότητα διαχωρισμού. Η ανάλυση των διαφορών των μέσων τιμών έκφρασης των πρωτεϊνών που μελετήθηκαν μεταξύ των δύο συστάδων κυτταρικού πολλαπλασιασμού έδειξε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών: Ki-67, κυκλίνη A, κυκλίνη B1, κυκλίνη D3, κυκλίνη E και bcl6 (όλα p<0.001), JunB (p=0.033), JunD (p=0.027) και MUM-1/IRF-4 (p=0.006) στην συστάδα υψηλού κυτταρικού πολλαπλασιασμού (T-test). Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι οι πρωτεΐνες της οικογένειας Jun και η πρωτεΐνη ph-STAT3 εκφράζονται σε DLBCL. Η συσχέτιση της έκφρασης των πρωτεϊνών JunB και JunD με τη συστάδα των DLBCL υψηλού κυτταρικού πολλαπλασιασμού υποδεικνύει ότι η αυξημένη έκφραση τους μπορεί να εμπλέκεται στη παθογένεση των DLBCL, επάγοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η συσχέτιση μεταξύ JunB και non-GC ανοσοφαινότυπου ίσως να οφείλεται στην ρύθμιση της JunB από τον NFκB, δεδομένου ότι στο κλασικό λέμφωμα Hodgkin η JunB βρίσκεται υπό τον έλεγχο του NFκB και είναι γνωστό ότι ο NFκB είναι ενεργοποιημένος στον ανοσοφαινοτυπικό υπότυπο των non-GC DLBCL. Η συσχέτιση των πρωτεϊνών JunD and Bcl-6 συμφωνεί με το εύρημα ότι η JunD ενισχύει την έκφραση του Bcl-6 των Β-κυττάρων του βλαστικού κέντρου του ποντικού. Η ανώμαλη μεθυλίωση του εκκινητή του γονιδίου JunB πιθανώς να είναι ο υποκείμενος μηχανισμός στις περιπτώσεις με χαμηλή έκφραση της JunB πρωτεΐνης.