In vitro μελέτη της αντιγονο-εξαρτώμενης αλλαγής ισοτύπου και επαγωγής σωματικών μεταλλαγών στο γονίδιο των ανοσοσφαιρινών σε ανθρώπινα Β λεμφοκύτταρα

Abstract

Main goal of the present study was the development of an in vitro culturing system of humanB lymphocytes simulating the human thymus dependent humoral immune response. The strategy was: 1) define the culture conditions according to my theoretical model, 2) design and construct immunogenic antigen formulations, 3) induce secretion of antibodies of desired specificity, 4) induce isotype switch, 5) induce the somatic mutation mechanism and 6) evaluate the liposomes as an antigen delivery system. The conditions of the culture system were defined based on the theory that the main event that drives the differentiation of the B cell during the immune response is its interaction with a properly activated T cell. In our system this interaction was achieved through normal antigen presentation of the B cell to the T cell. Selection of appropriate T cell epitope from tetanus toxoid enabled us to recruit the population of already existing memory T cells from potential donors. As B cell antigens were selected: 1) V3 region of gp120 of HIV-1 (LAI) representative of foreign antigens and 2) the core of MUC-1 representative of autologous antigens. The in vitro culture system succeeded in inducing specific antibodies against both the V3 and the autologous antigen MUC-1. It also succeeded in inducing maturation of the immune response through isotype switching of the resulting antibodies from IgM to IgG. In the next phase utilizing single B cell cultures we showed that the in vitro system could induce the somatic mutation machinery and produce mutations and produce mutations in the immunoglobulin genes of the B cells. Expression in bacterial strains of the mutated antibodies showed that they were specific for the immunizing antigen proving that the induction of mutation was antigen related. Finally the study of the liposomes showed that they represent a potent alternative of the soluble antigen. The spectacular finding regarding the liposomes was that when they are covered with the V3 peptide from gp120 of HIV-1 exerts a stimulatory effect on memory T cells. Further study of the liposomes showed that the phenomenon is strictly V3 dependent and that it appears during the interaction of the antigenpresenting cell and the memory T cell. These results give a new perspective in the pathology of HIV.

Βασικός στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός in vitro συστήματος καλλιέρ-γειας ανθρώπινων Β κυττάρων το οποίο να προσομοιάζει κατά το βέλτιστο δυνατόν την ανθρώπινη χυμική ανοσιακή απάντηση εναντίον των θυμοεξαρτώμενων αντιγόνων. H στρατηγική περιελάμβανε: (α) ανασύσταση των συνθηκών στις οποίες συμβαίνει φυσιολογικά η χυμική ανοσιακή απάντηση με βάση το δικό μας θεωρητικό μοντέλο, (β) σχεδίαση και κατασκευή ενός συνδυασμού αντιγόνων αυ-στηρά καθορισμένων, με υψηλή ανοσογονικότητα, (γ) επαγωγή αντιγονοειδικών ανοσοσφαιρινών, (δ) αλλαγή του ισότυπου των παραγόμενων αντισωμάτων, (ε) επαγωγή του μηχανισμού των σωματικών μεταλλαγών και (στ) αξιολόγηση των λιποσωμάτων ως εναλλακτική μέθοδο χορήγησης των αντιγόνων καθώς και ως τεχνική σύνδεσης T και B επιτόπων. Το μοντέλο του συστήματος που σχεδιάστηκε βα-σίστηκε στην θεωρία ότι το κεντρικό γεγονός που καθορίζει την πορεία διαφοροποίησης του Β κυττά-ρου και συνακόλουθα της χυμικής απάντησης είναι η επαφή του αντιγονοειδικού Β κυττάρου με το αντίστοιχο αντιγονοειδικό Τ κύτταρο βοηθός. Στην δική μας προσέγγιση η ανασύσταση της αλληλεπί-δραση του Τ με το Β κύτταρο έπρεπε να επιτευχθεί μέσω της φυσιολογικής παρουσίασης αντιγόνου. Με την επιλογή κατάλληλου Τ επιτόπου από το τοξοειδές του τετάνου έγινε προσπάθεια εκμετάλλευ-σης του έτοιμου πληθυσμού ώριμων Τ κυττάρων μνήμης σε κάθε δότη. Τα Β αντιγόνα στόχοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 1) η V3 περιοχή της gp120 ως εκπρόσωπος των εξωγενών αντιγόνων και 2) ο πυρήνας επανάληψης της βλεννίνης MUC-1 ως εκπρόσωπος των αυτοαντιγόνων. Το πρώτο βήμα της ανοσοποίησης περιλάμβανε πολυκλωνική και αντιγονοειδική ενεργοποίηση ταυτοχρόνως πετυχαίνο-ντας ενεργοποίηση και αύξηση του πληθυσμού των Β κυττάρων. Στο δεύτερο βήμα της ανοσοποίησης δημιουργήθηκαν οι προϋποθέσεις ώστε Τ και Β κύτταρα να αλληλεπιδράσουν. Με την βοήθεια του in vitro συστήματος επιτεύχθηκε η παραγωγή αντιγονοειδικών ανοσοσφαιρινών τόσο με το εξωγενές όσο και με το ενδογενές αντιγόνο. Έλεγχος του ισότυπου αυτών των αντισωμάτων έδειξε ότι μετά το πρώτο βήμα της ανοσοποίησης ήταν αποκλειστικά IgM. Μόνο μετά το δεύτερο βήμα παρατηρήθηκαν και IgG αντιγονοειδικά αντισώματα σε μεγάλο ποσοστό των δοτών που χρησιμοποιήθηκαν. Στη συνέ-χεια, σε καλλιέργειες ενός μοναδικού Β κυττάρου αποδείξαμε ότι το σύστημα in vitro ανοσοποίησης έχει τις προϋποθέσεις (απαιτούμενα σήματα) για να επάγει το μηχανισμό σωματικών μεταλλαγών στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών των Β κυττάρων. Έκφραση στα βακτήρια των μεταλλαγμένων αντισωμά-των έδειξε ότι έφεραν ειδικότητα για το αντιγόνο της ανοσοποίησης και επιβεβαιώθηκε έτσι ότι η επα-γωγή των σωματικών μεταλλαγών στο σύστημα είναι αντιγονο-εξαρτώμενη. Συνοψίζοντας το in vitro σύστημα ανοσοποίησης αποδείξαμε ότι επιτυγχάνει α) επαγωγή αντισωμάτων επιθυμητής ειδικότητας, β) αλλαγή ισότυπου και γ) επαγωγή του μηχανισμού σωματικών με-ταλλαγών. Δηλαδή το σύστημα αναπαριστά μεγάλο μέρος των διαδικασιών της χυμικής ανοσιακής απάντησης. Τέλος η μελέτη των λιποσωμάτων ως φορείς αντιγόνου έδειξε ότι έχουν την δυνατότητα να αποτελέσουν εναλλακτική λύση στην χορήγηση του διαλυτού αντιγόνου. Ωστόσο το εκπληκτικό αποτέλεσμα της εργασίας μας πάνω στα λιποσώματα ήταν η ανακάλυψη της ειδικής διεγερτικής ικανότητας των λιποσωμάτων που φέρουν επίστρωση με το V3 πεπτίδιο από την gp120 του HIV-1. Μελέτη αυτών των λιποσωμάτων έδειξε ότι το φαινόμενο οφείλεται σε αποκλειστική ικανότητα της V3 περιοχής και εκδηλώνεται κατά την διάρκεια της παρουσίασης αντιγόνου από το κύτταρο παρουσιαστή στο Τ κύτταρο μνήμης. Τα αποτελέσματα φωτίζουν μια νέα πιθανή πτυχή της παθοφυσιολογίας του HIV.