Συμβολή στη μελέτη της ευκαρυωτικής παγοπυρήνωσης: ανάπτυξη μεθόδου επιλογής φυτών καπνού (Nicotiana tabacum L.) ανθεκτικών στο πάγωμα και απομόνωση παγοπυρηνωτικού γονιδίου από τον μύκητα Fusarium acumitatum

Abstract

The susceptibility of plants to frost is often due to ice nucleating bacteria and fungi. By producing certain proteins, these microorganisms cause plants to freeze at relatively warm subzero temperatures. This phenomenon is known as biological ice nucleation and has been a subject of research for more than 25 years. This study is part of a research effort aiming at the identification of the factors that relate to the biological ice nucleation and freezing injury in eukaryotic systems.In the first part of this study the use of transgenic tobacco plants expressing the ice nucleation gene inaZ from Pseudomonas syringae is described. The first part of this study refers to the development of the required methodology for the large screening of heterozygous (inaZ +/-) plants for the identification of mutants with reduced freezing susceptibility after γ ray irradiation. The methodology that has been developed is based on two freezing assays. The first is applied on small seedlings whereas the second is applied on leaf discs from selected plants. Both freezing assays are carried out in microtitter plates floating the surface of a cooling bath. The second part of this study deals with the cloning of an ice nucleation cDNA from the fungus Fusarium accuminatum. Two cDNA libraries were constructed with different average insert sizes. The identification of the ice nucleation cDNA was accomplished using a combination of heterologous hybridization and a new functional assay. This assay is simple and rapid and can be used for the cloning of other icenucleation genes. It is based on the induced expression of cDNA clones from the library and the functional screening a) of phage plaques, after blotting of phage expressed proteins on filters and b) bacterial colonies after in vivo phagemids excision. The cloning of the ice nucleation cDNA clone was confirmed by transforming bacteria and checking for ice nucleation activity. The ice nucleation activity of the isolated cDNA was compared to that of the inaZ gene and of the fungus from which itwas isolated. The cDNA was sequenced and the structure of the predicted protein product was analysed in silico. The protein lacks conserved amino acid repeats similar to these found in the bacterial counterparts, though there are some imperfect repeats of different nature. The protein also shows segment homology to glycosylhydrolases and contains antifreeze motifs in different parts of the molecule.

Η ευπάθεια των φυτών στο παγετό συχνά οφείλεται στην παρουσία παγοπυρηνωτικών βακτηρίων και μυκήτων. Οι μικροοργανισμοί αυτοί προκαλούν πάγωμα στα φυτά εξαιτίας κάποιων πρωτεϊνών που παράγουν. Το φαινόμενο είναι γνωστό σαν βιολογική παγοπυρήνωση και αποτελεί αντικείμενο έρευνας για πάνω από 25 χρόνια. Η παρούσα μελέτη αποτελεί μέρος μίας ερευνητικής προσπάθειας με απώτερο στόχο τον προσδιορισμό των παραγόντων που σχετίζονται με το φαινόμενο της βιολογικής παγοπυρήνωσης σε ευκαρυωτικά συστήματα και την αξιοποίησή του στη βιοτεχνολογία και την γενετική βελτίωση φυτών για αντοχή σε παγετούς. Στο πρώτο μέρος αυτής της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν διαγονιδικά φυτά καπνού μετασχηματισμένα με το παγοπυρηνωτικό γονίδιο inaZ του βακτηρίου Pseudomonas syringae. Το πρώτο μέρος αυτής της μελέτης αναφέρεται στην ανάπτυξη της αναγκαίας μεθοδολογίας για τον έλεγχο μεγάλου αριθμού ετερόζυγων (inaZ +/-) φυτών και την επιλογή εκείνων των φυτών που εξαιτίας ακτινοβόλησής τους με ακτίνες γ, επιβιώνουν μετά από έκθεση σε θερμοκρασίες παγετού. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε για επιλογή ανθεκτικών φυτών περιελάμβανε δύο δοκιμές παγώματος. Η πρώτη μαζική παραγωγή έγινε σε στάδιο σποροφύτων, ενώ η δεύτερη έγινε σε δισκία φύλλου από τα επιλεγμένα φυτά της πρώτης δοκιμής. Και οι δύο δοκιμές παγώματος έγιναν σε μικροτριβλία που επέπλεαν στην επιφάνεια ψυχόμενου αλκοολόλουτρου σε θερμοκρασίες υπό το °C. Απομονώθηκαν έτσι φυτά καπνού με αυξημένη αντοχή σε υπό το μηδέν θερμοκρασίες. Το δεύτερο μέρος αυτής της μελέτης αφορά την απομόνωση ενός παγοπυρηνωτικού cDNA κλώνου από τον μύκητα F. acuminatum. Για τον σκοπό αυτό κατασκευάσθηκαν δύο cDNA βιβλιοθήκες σε φορέα λZAP II, που διέφεραν ως προς το μέσο μέγεθος των ενθέτων τους. Το παγοπυρηνωτικό cDNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό ετερόλογης υβριδοποίησης και μίας νέας λειτουργικής δοκιμής. Η δοκιμή αυτή είναι απλή και γρήγορη και μπορεί να χρησιμοποιηθεί και στην απομόνωση και άλλων παγοπυρηνωτικών γονιδίων. Βασίζεται στην επαγομένη έκφραση cDNA των κλώνων της βιβλιοθήκης και την ¨λειτουργική σάρωση¨ α) πλακών φάγων, μετά από μεταφορά των πρωτεϊνών τους σε φίλτρα μεμβρανών και β) αποικιών βακτηρίων μετά από in vivo εκτομή φαγεμιδίων. Η απομόνωση του παγοπυρηνωτικού cDNA κλώνου επιβεβαιώθηκε με μετασχηματισμό βακτηρίων και με έλεγχο της παγοπυρηνωτικής δράσης τους. Η παγοπυρηνωτική δράση του απομονωμένου κλώνου συγκρίθηκε με αυτή του γονιδίου inaZ και με την αντίστοιχη υγρής καλλιέργειας του μύκητα από τον οποίο απομονώθηκε. Ακολούθησε αλληλούχιση του παγοπυρηνωτικού cDNA κλώνου και in silico ανάλυση της προβλεπόμενης δομής της παγοπρωτεΐνης που κωδικοποιεί, σύμφωνα με την οποία στο μόριο της παγοπρωτεΐνης δεν υπάρχουν οι συντηρημένες επαναλήψεις αμινοξικών αλληλουχιών που χαρακτηρίζουν της βακτηριακές παγοπρωτεΐνες, αν και υπάρχουν ορισμένες ατελείς αμινοξικές επαναλήψεις. Η προβλεπόμενη δομή της παγοπρωτεΐνης έχει τμηματική ομολογία με γλυκοϋδρολάσες και περιέχει αντιπαγοτικά μοτίβα σε διαφορετικά τμήματα του μορίου.