Μελέτη ενδοφυτικών βακτηρίων από την Calendula officinalis και ριζοσφαιρικών βακτηρίων από το Phaseolus vulgaris που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών

Abstract

The adverse effects of the overuse of chemical plant protection and fertilization products on the environment and living organisms have led to the research and application of new, alternative and environmentally-friendly products aiming towards sustainable agriculture. Application of beneficial rhizospheric or endophytic bacteria is a safe agricultural practice, as they enhance plant growth and resistance to biotic and abiotic stresses. In the current study, 119 culturable endophytic bacteria in leaves, root and flowers of the medicinal plant Calendula officinalis were isolated and studied along with Pseudomonas carnis X strain isolated from Phaseolus vulgaris rhizosphere. The morphological and phylogenetic analysis of 37 representative endophytic strains revealed that they belong to Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Stenotrophomonas and Pantoea genera. Selected endophytic strains were studied futher regarding their direct and indirect modes of action as well as their survival ability during extreme growth conditions. The in vitro application of representative strains to Arabidopsis thaliana Col-0 plantlets and the biopriming application on Solanum lycopersicum var. Chondrokatsari Messinias seeds, strongly affected plant growth and morphological characteristics, possibly due to the production of phytohormones and bacterial volatile compounds (BVCs), efficient colonization and increase of nutrient bioavailability. Furthermore, the in vitro antagonistic ability against phytopathogenic fungi was studied, namely Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici και Botrytis cinerea in vitro, with strains belonging to B. velezensis, B. subtilis και B. halotolerans being the most effective. The antagonistic activity was attributed to the production of diffusible antifungal compounds, an effect observed also during microscopic observation against Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici. Endophytic strains B. halotolerans Cal.l.30, B. velezensisCal.r.29 and B. halotolerans Cal.f.4 as well as rhizospheric strain P. carnis X that stood out in tests in vitro, were also effective against B. cinerea in detached tomato and grape fruit but also against Colletotrichum acutatum in detached olive fruit. Spesifically, the selected compteting strains equally reduced the disease severity index (DSI %) in tomato fruits with a percentage between 11-18% and in olive fruits with a percentage between 24-27%, while in grape berries the bacterial strain Cal.r.29 presented the best results with a percentage of 13%. Metabolomic analysis by UHPLC-ESI HRMS of strains Cal.l.30 and Cal.r.29 combined with in silico genomic analysis of Cal.l.30, Cal.f.4 and X, highlighted a plethora of strong antimicrobial and other secondary metabolites involved in bacterial antagonistic ability. Specifically, Bacillus strains produced cyclic lipopetides of surfactin, fengycin and iturin families, the precursor of antibiotic dipeptide bacilysin (L-dihydroanticapsin), the polyketide bacillaene, the antibacterial compound oxydifficidin, the siderophore compound bacillibactin and drastic compound azelaic acid. In silico analysis of P. carnis X genome revealed biosynthetic gene clusters (BGCs) involved in the biosynthesis of cyclic lipopeptide viscosinamide, siderophore compound pyoverdin and confirmed existence of type VI secretion system (T6SS). These compounds, besides the direct antagonistic activity, also act as ISR elicitors and activate plant defense mechanisms either on the contact point or systemically. So, the effect of bacterial strains Cal.l.30, Cal.r.29, Cal.f.4 and Χ was further studied on the growth, ISR activation and protection of tomato plants under greenhouse conditions by applying them as individual inoculants or two-strain mixtures. Specifically, after bacterial formulation, a significant reduction of the disease severity index (DSI %) was observed with a percentage between 20-27%, compared to the control plants with a percentage of 78%. Bacterial application on plant roots activated salicylic acid and jasmonic acid/ethylene pathways. Specifically, this study focused on the induction of gene expression of PR1, PR2, PR3, involved in salicylic acid pathway as well as ERF1, ACO1 και TomLoxAthat are involved in jasmonic acid/ethylene pathway. Combination of the right strains can result in powerful bacterial mixtures that are able to act additively and synergistically towards enhancement of plant growth and protection, compared with individual strains. In this study, bacterial mixtures that achieved better compatibility in the in vitro assays, achieved better results in the in vivo and in planta application. So, the bacterial mixtures Cal.l.30- Cal.f.4 and Cal.r.29- X, performed better in terms of morphological and growth characteristics of tomato plants, as well as in terms of plant protection from phytopathogenic fungus B.cinerea by ISR activation. Concluding, the study of endophytic bacteria from the medicinal plant Calendula officinalis and P. carnis X from Phaseolus vulgaris discovered a number of BCAs and PGP strains, and underlined that appropriate pairwise combinations of them can be a more powerful and effective solution than individual inoculation.

Η εκτεταμένη χρήση στην εντατική γεωργία χημικών φυτοπροστατευτικών προϊόντων, φυτοφαρμάκων όσο και λιπασμάτων έχει ως αποτέλεσμα δυσμενείς επιπτώσεις στο περιβάλλον και τους ζωντανούς οργανισμούς, που οδήγησαν στην ανάγκη εύρεσης νέων, εναλλακτικών και ασφαλέστερων εφαρμογών που στόχο έχουν μια φιλική προς το περιβάλλον και εξίσου αποτελεσματική αειφόρο γεωργία. Η εφαρμογή ωφέλιμων ριζοσφαιρικών ή ενδοφυτικών βακτηρίων μπορεί να αποτελέσει μια ανταγωνιστική και ασφαλή πρακτική διαχείρισης των καλλιεργειών, καθώς ενισχύουν την ανάπτυξη και την αντοχή των φυτών σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις. Στην παρούσα μελέτη απομονώθηκαν και μελετήθηκαν 119 ενδοφυτικά βακτηριακά στελέχη από φύλλα, ρίζα και άνθη του φαρμακευτικού φυτού Calendula officinalis, καθώς και το βακτηριακό στέλεχος P. carnis X απομονωμένο από τη ριζόσφαιρα του Phaseolus vulgaris. Η μορφολογική και φυλογενετική ανάλυση σε 37 αντιπροσωπευτικά ενδοφυτικά στελέχη απέδειξε ότι ανήκουν στα γένη Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Stenotrophomonas και Pantoea. Τα επιλεγμένα ενδοφυτικά βακτήρια του φαρμακευτικού φυτού C. officinalis μελετήθηκαν εκτενέστερα ως προς το πλήθος των άμεσων και έμμεσων μηχανισμών δράσης τους, καθώς και για την ικανότητα επιβίωσής τους σε ακραίες συνθήκες ανάπτυξης. Η in vitro εφαρμογή αντιπροσωπευτικών στελεχών σε φυτά Arabidopsis thaliana Col-0 και ο εμβολιασμός τους με βιο- κάλυψη σε σπόρους Solanum lycopersicum var. Chondrokatsari Messinias, επηρέασε σημαντικά την ανάπτυξη και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των φυτών, με τη σύνθεση και παραγωγή φυτοορμονών, την παραγωγή βακτηριακών πτητικών ενώσεων (ΒVCs), τον καλό αποικισμό των βακτηρίων και την αφομοίωση των απαραίτητων θρεπτικών στοιχείων, να αποτελούν πιθανούς μηχανισμούς δράσης. Επιπλέον, μελετήθηκε η ανταγωνιστικότητα των μελετώμενων βακτηρίων εναντίον των φυτοπαθογόνων μυκήτων Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici και Botrytis cinerea in vitro, με τα είδη B. velezensis, B. subtilis και B. halotolerans να ξεχωρίζουν συγκριτικά με τα υπόλοιπα είδη βακτηρίων. Η αποτελεσματική παρεμπόδιση των φυτοπαθογόνων μυκήτων συνδυάστηκε με την άμεση επίδραση των παραγόμενων και διαχεόμενων αντιμικροβιακών ενώσεων των βακτηριακών στελεχών στο μέσο ανάπτυξης, όπως επιβεβαιώθηκε και μικροσκοπικά εναντίον του φυτοπαθογόνου μύκητα Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici. Τα ενδοφυτικά βακτήρια B. halotolerans Cal.l.30, B. velezensis Cal.r.29 και B. halotolerans Cal.f.4, καθώς και το ριζοσφαιρικό βακτήριο P. carnis X που ξεχώρισαν για την in vitro ανταγωνιστικότητά τους, παρεμπόδισαν σημαντικά τους φυτοπαθογόνους μύκητες B. cinerea και Colletotrichumacutatum σε μετασυλλεκτικές εφαρμογές in vivo, σε καρπούς τομάτας και σταφυλιού, αλλά και ελιάς αντίστοιχα. Συγκεκριμένα, τα επιλεγμένα ανταγωνιστικά στελέχη μείωσαν εξίσου σημαντικά το δείκτη σοβαρότητας της ασθένειας (DSI %) σε καρπούς τομάτας με ποσοστό μεταξύ 11-18% και σε καρπούς ελιάς με ποσοστό μεταξύ 24-27%, ενώ στους καρπούς σταφυλιού ξεχώρισε η εφαρμογή του βακτηρίου Cal.r.29 με ποσοστό 13%. Η μεταβολομική ανάλυση με UHPLC-ESI HRMS των στελεχών Cal.l.30 και Cal.r.29 σε συνδυασμό με την in silico ανάλυση των γονιδιωμάτων των στελεχών Cal.l.30, Cal.f.4 και X, ανέδειξαν ένα πλήθος ισχυρών αντιμικροβιακών ενώσεων και δευτερογενών μεταβολιτών που εμπλέκονται στον ανταγωνισμό των βακτηρίων. Συγκεκριμένα, τα βακτήρια του γένους Bacillusξεχώρισαν για την παραγωγή των ισχυρών κυκλικών λιποπεπτιδίων των οικογενειών surfactin, fengycin και iturin, της πρόδρομης ένωσης του αντιβιοτικού διπεπτιδίου bacilysin(L-dihydroanticapsin), το πολυκετίδιο bacillaene, την αντιβακτηριακή ένωση oxydifficidin, τη σιδηροφόρο ένωση bacillibactin και τη δραστική ουσία azelaic acid. Αντίστοιχα η in silicoανάλυση του γονιδιώματος του βακτηρίου P. carnis X ανέδειξε τις συστάδες γονιδίων για τη βιοσύνθεση του κυκλικού λιποπεπτιδίου viscosinamide, της σιδηροφόρου ένωσης pyoverdinκαι επιβεβαίωσε την ύπαρξη του εκκριτικού συστήματος τύπου VI (T6SS). Οι ενώσεις αυτές, εκτός από την άμεση ανταγωνιστική τους δράση, λειτουργούν παράλληλα ως διεγέρτες της επαγόμενης διασυστηματικής αντοχής (ISR), για την ενεργοποίηση των αμυντικών μηχανισμών των φυτών, είτε στον ιστό επαφής, είτε διασυστηματικά. Έτσι, μελετήθηκε επιπλέον η επίδραση των βακτηριακών στελεχών Cal.l.30, Cal.r.29, Cal.f.4 και Χ σε συνθήκες θερμοκηπίου στην ανάπτυξη και την ενεργοποίηση της επαγόμενης διασυστηματικής αντοχής (ISR) καθώς τελικά και την προστασία των φυτών τομάτας από το φυτοπαθογόνο μύκητα B. cinerea, μετά από την εφαρμογή των βακτηρίων είτε ως μεμονωμένα στελέχη είτε ως ζεύγη σε μίγματα. Συγκεκριμένα, μετά από την εφαρμογή των βακτηρίων παρατηρήθηκε σημαντική μείωση του δείκτη σοβαρότητας της ασθένειας (DSI %)με ποσοστό μεταξύ 20- 27%, σε σύγκριση με τα φυτά του μάρτυρα με ποσοστό 78%. Hεφαρμογή των βακτηρίων στις ρίζες των φυτών τομάτας ενεργοποίησε τα μονοπάτια του σαλικυλικού οξέος και του γιασμονικού οξέος/ αιθυλενίου. Συγκεκριμένα αυξήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων PR1, PR2, PR3 που εμπλέκονται στο μονοπάτι του σαλικυλικού οξέος και των ERF1, ACO1 και TomLoxA που εμπλέκονται στο μονοπάτι του γιασμονικού οξέος/ αιθυλενίου. Ακολούθως μελετήθηκε η δράση των στελεχών αυτών ως μίγματα και η πιθανή συμβατότητά τους. Ο συνδυασμός των κατάλληλων στελεχών μεταξύ τους μπορεί να δημιουργήσει ισχυρά μίγματα βακτηρίων, με αποτέλεσμα να ενισχύσουν αθροιστικά την αποτελεσματικότητά τους στην ανάπτυξη και προστασία των φυτών, σε σύγκριση με τα μεμονωμένα στελέχη. Στην παρούσα μελέτη τα μίγματα βακτηρίων που εμφάνισαν τη βέλτιστη συμβατότητα in vitro, παρουσίασαν παράλληλα και καλύτερα αποτελέσματα στις in vivo και in planta εφαρμογές. Έτσι, τα μίγματα βακτηρίων Cal.l.30-Cal.f.4 και Cal.r.29- X, διακρίθηκαν για τη συνδυαστική τους δράση και τη βελτίωση τόσο των μορφολογικών και αναπτυξιακών χαρακτηριστικών των φυτών τομάτας, όσο και για την προστασία τους από το φυτοπαθογόνο μύκητα B. cinerea λόγω της ενεργοποίησης του μηχανισμού ISR. Επομένως, η ολοκληρωμένη μελέτη των ενδοφυτικών βακτηρίων του φαρμακευτικού φυτού C. officinalis και του ριζοσφαιρικού βακτηρίου P. carnis X από το φυτό P. vulgaris ανέδειξε σημαντικό αριθμό ανταγωνιστικών BCAs και PGP στελεχών, τα οποία μετά από κατάλληλο συνδυασμό μεταξύ τους μπορούν να αποτελέσουν ισχυρά και αποτελεσματικά μίγματα βακτηρίων.