Ποσοτικοποίηση των στελεχών του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV) με τις μεταλλαγές που προσδίδουν αντοχή στην αντιϊκή θεραπεία

Abstract

BACKGROUND: Resistance has frequently been associated with the emergence of resistance-associated mutations and is a major problem when treating patients with hepatitis B virus (HBV) infection. Conventional methods often fail to detect HBV viral subpopulations if they are represented in less than 20% of the total.AIM: Development of a novel method for the quantitative detection of HBV subpopulations with major resistance associated mutations (V173L, L180M, A181V, T184A, M204I/V and N236T).METHODS: Amplification Refractory Mutation System real-time PCR (ARMS rt-PCR) was combined with molecular beacon using the LightCycler system.RESULTS: ARMS rt-PCR with molecular beacon showed a sensitivity of 10 copies/reaction and analytical sensitivity 95% for mutant variant and 100% for wild-type variant. Discriminatory ability is 0.01%-0.25%. In HBV naïve patients viral populations with resistance associated mutations (V173L, L180M, A181V, T184A, M204I and N236T) were present in 38/60 (63.3%). In HBV treated patients who have shown resistance, viral populations with resistance associated mutations were present both as dominant and minor variants, probably affecting the patients’ resistance profile.CONCLUSIONS: Although the sensitivity, precision (inter-assay, intra-assay) and discriminatory ability of the ARMS rt-PCR with molecular beacon is similar to other ultra sensitive methods, such as ultra-deep sequencing, we show that the former can be applied in a cost-effective way for the detection of HBV subpopulations with major resistance associated mutations.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η ανάπτυξη αντοχής στην αντιϊκή θεραπεία έχει σχετισθεί με την εμφάνιση μεταλλαγών και αποτελεί ένα βασικό πρόβλημα στην αντιμετώπιση της λοίμωξης του ιού της ηπατίτιδας Β (HBV). Οι συμβατικές μέθοδοι αδυνατούν να ανιχνεύσουν ιϊκούς υποπληθυσμούς με τις μεταλλαγές αντοχής αν αντιπροσωπεύουν λιγότερο από το 20% του συνολικού πληθυσμού του ιού στο υπό εξέταση δείγμα. ΣΚΟΠΟΣ: Η δημιουργία μιας μεθόδου για την ποσοτικοποίηση των ιϊκών υποπληθυσμών του HBV με τις κυριότερες μεταλλαγές που προσδίδουν αντοχή στην αντιϊκή θεραπεία (V173L, L180M, A181V, T184A, M204I/V και N236T).ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΣ: Η μεθοδολογία του συστήματος αναστολής της γονιδιακής επέκτασης του μεταλλαγμένου τύπου με PCR πραγματικού χρόνου (amplification refractory mutation system, ARMS RT-PCR) συνδυάστηκε με την τεχνολογία του μοριακού φάρου (molecular beacon) χρησιμοποιώντας το σύστημα του LightCycler®. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η μέθοδος ARMS rt-PCR με μοριακό φάρο έχει ευαισθησία 10 αντιγράφων ανά αντίδραση και αναλυτική ευαισθησία 95% για το μεταλλαγμένο τύπο και 100% για το φυσικό τύπο. Η διακριτική ικανότητα της μεθόδου είναι 0.01%-0.25%. Ιϊκοί υποπληθυσμοί με τις μεταλλαγές αντοχής του HBV V173L, L180M, A181V, T184A, M204I και N236T βρέθηκαν σε υψηλή συχνότητα (38/60, 63.3%), σε δείγματα ασθενών με ηπατίτιδα Β, που δεν είχαν λάβει ποτέ θεραπεία με νουκλεοσ(τ)ιδικά ανάλογα. Σε 41 δείγματα ασθενών με HBV λοίμωξη, που είχαν λάβει θεραπεία, εκτός από τις μεταλλαγές αντοχής με επικρατούντα ιϊκό υποπληθυσμό, ανιχνεύθηκαν και ιϊκοί υποπληθυσμοί με μικρότερους λόγους, που πιθανόν να είχαν συμβάλλει στη συνολική εκδήλωση αντοχής για τον κάθε ασθενή.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η μέθοδος ΑRMS rt-PCR με μοριακό φάρο παρουσιάζει συγκρίσιμη ευαισθησία, πιστότητα και διακριτική ικανότητα με άλλες εξαιρετικά ευαίσθητες μοριακές μεθόδους, όπως είναι το ultra-deep sequencing, αλλά πλεονεκτεί σε θέματα κόστους για την ανίχνευση των ιϊκών υποπληθυσμών του ιού της ηπατίτιδας Β με τις κυριότερες μεταλλαγές αντοχής.