Μοριακή παθολογία νεφρικής ίνωσης

Abstract

Chronic Kidney Disease (CKD) is a condition detected in high frequency in all adult population (de Jong et al, 2008). Although CKD is the end result of several renal and systemic diseases, its common anatomical feature is the development of renal fibrosis. The molecular mechanisms and the macromolecules involved in the development of renal fibrosis are not well studied yet. Therefore, understanding the molecular mechanisms operating during the fibrotic procedure and finding early markers for its detection is of great importance. Fibrosis is often defined as a wound-healing response that has gone out of control and characterizes a broad disease spectrum in many organ systems. The main feature of fibrosis is the accumulation of fibroblasts and the massive production of extracellular matrix that leads to loss of tissue structure and function, and in many cases to organ failure and death.For the detailed examination of the molecules involved in renal fibrosis we carried out proteomic analysis of the renal cortex in the well-established rat model of unilateral ureteral obstruction (UUO model). Among the proteins that were differentially expressed between the control and the experimental animals was transgelin. Transgelin, a cytoskeletal protein, showed a significant upregulation in all experimental animals that sacrificed 8 days after ligation. The aim of the present study was to confirm transgelin upregulation, to identify the renal compartment and characterize the cells responsible for transgelin upregulation, to find a possible mechanism responsible for transgelin upregulation and to explore the possibility that transgelin is upregulated in certain diseases of the renal parenchyma.Transgelin upregulation was studied both at the protein level by Western blotting and at the mRNA level by RT-PCR. Identification of the renal compartment where transgelin exhibited upregulation following the development of fibrosis was carried on by immunohistochemistry. In order to identify the type of cells showing Transgelin upregulation, double immunofluorescence experiments using cell markers for immune/epithelial and endothelial cells as well as activated fibrablasts were used. In order to find a mechanism for transgelin upregulation, promoter analysis of transgelin took place. In order to explore the possibility that transgelin upregulation may be detected in renal diseases, biopsy material from several patients (N=67) was examined by immunohistochemistry and double immunofluorescence.Two existing transcripts were found by Real-time PCR to exhibit slightly different kinetics. It was also observed that at early stages of fibrosis the interstitial compartment was mainly expressing transgelin and more specifically, cells surrounding the glomeruli. It was confirmed that transgelin expressing cells were fibroblast-like, based on their extensive co-distribution with α-SMA and their complete lack of co-distribution with, Galectin-3, CD11b and RECA-1. Furthermore, no co-distribution of transgelin with S100A4/FSp1 was observed. These periglomerular fibroblasts exhibited staining for transgelin both cytoplasmic and nuclear. From promoter analysis, it was found that among many transcription factors that have binding sites on transgelin promoter, only Kruppel-like factor 6 was found to be upregulated in transgelin positive periglomerular activated fibroblasts. This finding is important for the mechanism of transgelin upregulation. Finally, at least in the cases of membranous nephropathy, IgA nephropathy and Focal Segmental Glomerulosclerosis, transgelin was expressed in glomeruli and periglomerular fibroblast-like cells, whereas in control biopsies Transgelin was never detected in these sites.These data strongly suggest that transgelin is upregulated in fibrotic renal diseases and could be used as a novel marker for renal fibrosis in the future.

Είναι ευρέως γνωστό ότι η Χρόνια Νεφρική Νόσο (ΧΝΝ) είναι μία κατάσταση που εντοπίζεται σε μεγάλη συχνότητα στους ενήλικες (de Jong et al, 2008). Αν και η ΧΝΝ είναι το τελικό αποτέλεσμα αρκετών νεφρικών και συστημικών ασθενειών, το πιο κοινό χαρακτηριστικό της, ανεξάρτητα από την αιτιολογία, είναι η ανάπτυξη νεφρικής ίνωσης. Οι μοριακοί μηχανισμοί και τα μακρομόρια που εμπλέκονται στην ανάπτυξη της νεφρικής ίνωσης δεν έχουν μελετηθεί πλήρως. Για το λόγο αυτό, είναι πολύ σημαντικό να κατανοηθούν οι μοριακοί μηχανισμοί που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της ινωτικής διαδικασίας και να βρεθούν πρώιμοι μάρτυρες για την έγκαιρη ανίχνευσή της.Η ίνωση ορίζεται συχνά ως μια διαδικασία επούλωσης τραύματος που έχει διαφύγει από τον έλεγχο του οργανισμού, χαρακτηρίζοντας μεγάλο εύρος ασθενειών σε πολλά οργανικά συστήματα. Κύριο γνώρισμα της ίνωσης αποτελεί η συσσώρευση κυττάρων ινοβλαστών και η ανεξέλεγκτη παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας που οδηγεί σε απώλεια της δομής και λειτουργίας του ιστού, και σε πολλές περιπτώσεις οργανική ανεπάρκεια και θάνατο.Με σκοπό την πληρέστερη εξέταση των μορίων που εμπλέκονται στη νεφρική ίνωση, πραγματοποιήσαμε πρωτεωμική ανάλυση του νεφρικού φλοιού στο καθιερωμένο μοντέλο της μονόπλευρης απόφραξης ουρητήρα στον αρουραίο (UUO model). Μεταξύ των πρωτεϊνών που έδειξαν διαφορική έκφραση ανάμεσα στα ζώα μάρτυρες και στα ινωτικά ζώα είναι η τρανσγελίνη. Η τρανσγελίνη, μία πρωτεΐνη του κυτταροσκελετού που φυσιολογικά συναντάται μόνο στα λεία μυϊκά κύτταρα, παρουσίασε σημαντική αύξηση σε όλα τα πειραματικά ζώα που θυσιάστηκαν οχτώ ημέρες μετά την απόφραξη του ουρητήρα.Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν, από την μία μεριά, η επιβεβαίωση της υπερέκφρασης της τρανσγελίνης, ο εντοπισμός της στον νεφρικό ιστό, ο χαρακτηρισμός των κυττάρων που την εκφράζουν και είναι υπεύθυνα για την αύξηση της έκφρασής της καθώς επίσης και ο μηχανισμός υπερέκφρασης της τρανσγελίνης στο ινωτικό μοντέλο της μονόπλευρης απόφραξης ουρητήρα σε τρωκτικό, και από την άλλη η μελέτη αρκετών νεφρικών ασθενειών στον άνθρωπο για να διαπιστωθεί η έκφραση της τρανσγελίνης στο νεφρικό ινωτικό ιστό ασθενών.Η υπερέκφραση της τρανσγελίνης μελετήθηκε τόσο σε επίπεδο πρωτεϊνης με Western Blotting, όσο και σε επίπεδο mRNA με RT-PCR. Ο εντοπισμός της τρανσγελίνης στο νεφρικό ιστό μετά την ανάπτυξη της ίνωσης πραγματοποιήθηκε με πειράματα ανοσοϊστοχημείας. Για να καθοριστεί το είδος των κυττάρων που υπερκφράζουν την τρανσγελίνη έλαβαν χώρα πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας δείκτες για κύτταρα του ανοσοποιητικού/ επιθηλιακά κύτταρα, για ενδοθηλιακά κύτταρα καθώς επίσης και για ενεργοποιημένους ινοβλάστες. Προκειμένου να βρεθεί ένας μηχανισμός μέσα από τον οποίο η τρανσγελίνη υπερεκφράζεται, προχωρήσαμε σε ανάλυση του υποκινητή της τρανσγελίνης. Τέλος, για να μελετήσουμε την πιθανότητα υπερέκφρασης της τρανσγελίνης σε νεφρικές ασθένειες, εξετάστηκε υλικό βιοψιών από αρκετούς ασθενείς (Ν=67) με ανοσοϊστοχημεία και διπλό ανοσοφθορισμό.Με Real-Time PCR, βρέθηκαν ότι δύο ισομορφές της τρανσγελίνης, αν και έχουν αυξημένη έκφραση στα ινωτικά ζώα, παρουσιάζουν ελαφρώς διαφορετικές κινητικές. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι ήδη από τα πρώιμα στάδια της ίνωσης (2 μέρες), η τρανσγελίνη εντοπίζεται σε ένα μεγάλο ποσοστό στο διάμεσο χώρο και κυρίως σε κύτταρα που περιβάλλουν τα σπειράματα. Επιβεβαιώθηκε ότι τα κύτταρα που εκφράζουν την τρανσγελίνη είναι κύτταρα που μοιάζουν με ινοβλάστες, με βάση τον εκτεταμένο και σε υψηλό ποσοστό συνεντοπισμό της τρανσγελίνης με την αSMA, ενώ δεν είναι ενδοθηλιακά, επιθηλιακά και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, βάση της έλλειψης συνεντοπισμού της τρανσγελίνης με το RECA-1, galectin 3 και το CD11b. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε συνεντοπισμός της τρανσγελίνης με την S100A4/FSp1. Επιπρόσθετα, αυτοί οι περισπειραματικοί ινοβλάστες φαίνεται πως εκφράζουν την τρανσγελίνη κυτταροπλασματικά και πυρηνικά. Με την ανάλυση του υποκινητή της τρανσγελίνης, βρέθηκε ότι ανάμεσα σε αρκετούς μεταγραφικούς παράγοντες που έχουν ειδικά σημεία πρόσδεσης επάνω στον υποκινητή της τρανσγελίνης, μόνο o Kruppel-like factor 6 (KLF6) μεταγραφικός παράγοντας φαίνεται να συνεντοπίζεται με την τρανσγελίνη. Το εύρημα αυτό είναι σημαντικό για το μηχανισμό μέσα από το οποίο η τρανσγελίνη υπερεκφράζεται.Τέλος, τουλάχιστον σε 3 (από τις 9) κατηγορίες νεφρικών παθήσεων που μελετήθηκαν, την μεμβρανώδη νεφροπάθεια, την IgA νεφροπάθεια και την εστιακή τμηματική σπειραματοσκλήρυνση, η έκφραση της τρανσγελίνης εντοπίστηκε στα σπειράματα και σε κύτταρα γύρω από τα σπειράματα που μοιάζουν με ινοβλάστες, ενώ σε φυσιολογικό νεφρικό ιστό ανθρώπου, η τρανσγελίνη δεν εντοπίστηκε ποτέ σε αυτά τα σημεία.Συνοψίζοντας, τα δεδομένα μας για την τρανσγελίνη δείχνουν ότι η έκφραση της αυξάνεται σε ινωτικές νεφρικές ασθένειες και θα μπορούσε στο μέλλον να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για την νεφρική ίνωση.