Πειραματική μελέτη της παραγωγής ενζύμων και πολύ(υδροξυ αλκανοϊκών) εστέρων (PHAs) από θερμόφιλους και μεσόφιλους μικροοργανισμούς

Abstract

In the present study, it was examined the microbial production of enzymes and biopolymers. The enzyme in study is lipase from the bacterium Thermus thermophilus HB8. For the increase of the lipase production it was examined the influence of the aeration and the carbon source. The better aeration increased the produced biomass and the intra-and extra-cellular lipase. For the examination of the effect of the carbon source, in the growth medium was added olive oil, sucrose and a combination of sucrose and olive oil. The oil increased the production of the biomass and the extracellular lipase while sucrose increased the produced intracellular lipase. The combination of the two carbon sources gave the best results of all cases since it increased the production of the biomass and total produced lipase. In order to characterize the biochemical properties of the Thermus thermophilus extracellular lipase, it was followed the following purification steps: precipitation with ammonium sulphate and ethanol and hydrophobic chromatography. The enzyme after the final purification step was quite clean and active. The molecular weight of the extracellular lipase is 56 kDa and is stable under neutral and alkaline environment and at high temperatures. In this study, it was also studied the immobilization of the commercial lipase Candida antarctica with physical adsorption on chitosan particles, with covalent bond on Eupergit ® C beads, and with encapsulation in alginates and alginate - polyvinyl alcohol particles. The immobilization of lipase on the chitosan particles resulted in a reduction of the enzyme activity, in contrast to the case of the encapsulation of lipase in the alginate particles where the enzyme activity was increased. In the second part of this study, it was examined the effect of different nutrients in the production of poly- (3-hydroxyalkanoates) from the bacterium Pseudomonas putida KT2442. Initially, it was studded the effect of two carbon sources (octanoic acid, glucose) in the production of PHA and it was found that the octanoic acid is consumed for PHA production while glucose for biomass production. For the increase of the PHA production, it was examined the feeding rate of the carbon and nitrogen sources and it was discovered that a sharp increase of the nitrogen source concentration leads from producing PHA to biomass production. However, with continuous addition of carbon and nitrogen sources the production of PHA was increased due to a biomass increase. In order to increase the PHA content, it was investigated the phosphorus limitation effect and it was found that phosphorus deficiency does not enhance the PHA accumulation but it acts as an inhibitor for the biomass growth. Finally, it was examined the effect of the magnesium in the PHA production and it was discovered that an increase of the magnesium concentration during cultivation leads to the termination of the bacterium growth or to a PHA content reduction. Studying the effect of various nutrients in the PHA production it was observed that the concentration of carbon and magnesium sources, during the culture affects the development of the polymer molecular weight.

Στην παρούσα εργασία μελετάται η βιοτεχνολογική παραγωγή ενζύμων και βιοπολυμερών. Το ένζυμο που μελετάται είναι η θερμοάντοχη λιπάση από το βακτήριο Thermus thermophilus HB8. Για την αύξηση της παραγωγής της λιπάσης μελετήθηκε η επίδραση του αερισμούς και της πηγής άνθρακα. Οι καλύτερες συνθήκες αερισμού, αύξησαν τη βιομάζα και την παραγωγή της συνολικής λιπάσης. Οι πηγές άνθρακα που μελετήθηκαν είναι το ελαιόλαδο, η σουκρόζη και συνδυασμός τους. Η παρουσία του ελαιόλαδου, αύξησε την παραγωγή της βιομάζας και της εξωκυττάριας λιπάσης. Αντίθετα, η σουκρόζη δεν επηρέασε ιδιαίτερα την παραγωγή της βιομάζας και της εξωκυττάριας λιπάσης, αύξησε όμως την παραχθείσα ενδοκυττάρια λιπάση. Ο συνδυασμός ελαιόλαδου και σουκρόζης, αύξησε την παραγωγή της βιομάζας και της συνολικής λιπάσης. Για το χαρακτηρισμός της εξωκυττάριας λιπάσης, πραγματοποιήθηκε καθαρισμός της. Τα στάδια καθαρισμού ήταν καθίζηση των πρωτεϊνών, με θειικό αμμώνιο και με αιθανόλη και με στήλη υδρόφοβής χρωματογραφίας βουτυλ-σεφαρόζης. Το ένζυμο μετά το τελικό στάδιο καθαρισμού ήταν αρκετά καθαρό και δραστικό. Η εξωκυττάρια λιπάση που παράγεται από το βακτήριο έχει μοριακό βάρος 56 kDa και είναι σταθερή σε ουδέτερο και αλκαλικό περιβάλλον, καθώς και σε υψηλές θερμοκρασίες. Με σκοπό την αύξηση της δραστικότητας της εμπορικής λιπάσης Candida antarctica με τη μέθοδο της καθήλωσης, μελετήθηκε η καθήλωση του ενζύμου με φυσική προσρόφηση σε σωματίδια χιτοζάνης, με ομοιοπολικό δεσμό σε σωματίδια Eupergit® C, και με εγκλεισμό σε αλγινικού και αλγινικού–πολυβινυλικής αλκοόλης σωματίδια. Η καθήλωση της λιπάσης στα σωματίδια χιτοζάνης είχε ως αποτέλεσμα να μειώσει τη δραστικότητα του ενζύμου, σε αντίθεση με τον εγκλεισμό της σε σωματίδια αλγινικού, όπου αυξήθηκε σε σχέση με το ελεύθερο ενζύμο. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, εξετάστηκε η επίδραση των θρεπτικών συστατικών στην παραγωγή του πολυ-υδροξυαλκανοϊκού εστέρα (mcl-PHA) από το βακτήριο Pseudomonas putida KT2442. Μελετώντας την επίδραση δυο πηγών άνθρακα (οκτανοϊκό οξύ, γλυκόζη) στη παραγωγή του ΡΗΑ διαπιστώθηκε ότι η γλυκόζη καταναλώνεται προς παραγωγή βιομάζας ενώ το οκτανοϊκό οξύ προς παραγωγή ΡΗΑ. Μελετώντας την επίδραση διαφορετικών αρχικών συγκεντρώσεων της πηγής αζώτου στη διεργασία παραγωγής του ΡΗΑ διαπιστώθηκε ότι η αρχική συγκέντρωση του αζώτου στο μέσο ανάπτυξης δεν επηρεάζει την παραγωγή του ΡΗΑ. Οπότε, για την αύξηση της παραγωγής του ΡΗΑ, εξετάστηκε ο τρόπος τροφοδοσίας των πηγών άνθρακα και αζώτου και διαπιστώθηκε ότι, μεγάλες μεταβολές της συγκέντρωσης της πηγής αζώτου, κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, οδηγεί προς παραγωγή βιομάζας από παραγωγή ΡΗΑ. Ωστόσο, με συνεχή προσθήκη άνθρακα και αζώτου η παραγωγή του ΡΗΑ αυξήθηκε αυξάνοντας την παραγόμενη βιομάζα. Για την αύξηση του συσσωρευμένου ΡΗΑ, μελετήθηκε η επίδραση της έλλειψης φώσφορου και διαπιστώθηκε, ότι η έλλειψη του φωσφόρου δεν ενισχύει τη συσσώρευση του ΡΗΑ άλλα δρα παρεμποδιστικά στην περαιτέρω ανάπτυξη του βακτηρίου. Τέλος, ερευνήθηκε η επίδραση του μαγνησίου στη βακτηριακή παραγωγή του ΡΗΑ και διαπιστώθηκε ότι, μια μεγάλη μεταβολή της συγκέντρωσης του μαγνησίου στο μέσο ανάπτυξης, κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας, οδηγεί στον τερματισμό της ανάπτυξης του βακτηρίου ή στη μείωση του περιεχόμενου ΡΗΑ. Μελετώντας την επίδραση των διαφόρων θρεπτικών συστατικών στην παραγωγή του ΡΗΑ, παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση της πηγής άνθρακα και μαγνησίου, στην πορεία της καλλιέργειας, επηρεάζει την εξέλιξη του μοριακού βάρους του πολυμερούς.