Expression of skeletal myosin light chain 2 in gilthead sea bream (Sparus aurata, L): regulation and correlation to growth markers

Abstract

In gilthead sea bream (Sparus aurata, L) skeletal muscle two isoforms of myosin light chain 2 (MLC2) are expressed, A and B. MLC2A is encoded by three transcripts produced through alternative polyadenylation signal selection differing in the 3’ untranslated region. cis-acting regulatory elements residing in 3’ UTRs were identified using bioinformatic analysis. Functionality of 3’ UTRs in interaction with the cell protein machinery was investigated in vitro using luciferase reporter constructs. Data indicated that the three transcripts are subject to differential regulation according to 3’ UTR length and regulatory interactions between transcripts were detected.Gene organization of the two isoforms and the syntenic relationships between Sparus aurata, Dicentrarchus labrax, Danio rerio, Gadus morhua, Gasterosteus aculeatus, Oryzias latipes and Tetraodon nigroviridis were studied. MLC2A and MLC2B genes contain 5 and 6 exons respectively in all organisms examined. Exon-intron organization is more similar among evolutionary closer species which is further confirmed by the phylogenetic tree probably indicating different evolutionary trajectories for the two MLC2 isoforms. Divergent expression patterns during myogenesis in primary muscle cell cultures and in developing larvae, and after administration of growth hormone to juveniles, indicated that the two isoforms of MLC2 identified in the gilthead sea bream are duplicated genes (paralogues) and have probably undergone subfunctionalization. White muscle development and growth processes occur through hyperplastic and hypertrophic events driven by several regulatory and hormonal factors. The development of white musculature in gilthead sea bream larvae demonstrated distinct hyperplastic and hypertrophic phases as evident by changes in muscle cellularity (number and size of muscle cells). The expression patterns of MLC2 marked the two phases in an isoform-specific manner; MLC2A marked new fiber formation in the germinal zones, appeared early in development and was correlated to myogenic factors; MLC2B was up-regulated only at hypertrophy in a later developmental stage and was correlated to muscle structural genes.The effect of rearing conditions to MLC2 isoform plasticity was determined in larvae and juvenile sea bream outcoming from the same egg-batch and raised under intensive versus mesocosm conditions as well as in juvenile gilthead sea bream reared under commercial aquaculture practices subjected to size-grading with sorters of increasing diameter. In the rearing systems experiment, larvae raised in mesocosm outperformed in growth and MLC2 isoform expression those raised under intensive. Results from the size-grading experiment suggested that somatic growth of juvenile gilthead sea bream was modestly improved. The ratio of MLC2A/MLC2B expression was significantly correlated to axial growth during the larval and early juvenile stages.Given the plastic versatility prevailing early development, the present results provide strong evidence of the robustness of MLC2 isoforms as markers of early growth.

Στον σκελετικό μυ της τσιπούρας (Sparus aurata, L) εκφράζονται δύο ισομορφές της ελαφριάς αλυσίδας 2 της μυοσίνης (myosin light chain 2; MLC2), Α και Β. Η MLC2Α κωδικοποιείται από τρία μετάγραφα που παράγονται με επιλογή του εναλλακτικού σήματος πολυαδενυλίωσης και διαφέρουν στην 3’ αμετάφραστη περιοχή (3’ untranslated region; 3’ UTR). cis-acting ρυθμιστικά στοιχεία που εδράζονται στα 3’ UTRs προβλέφθηκαν με προγράμματα βιοπληροφορικής. Η λειτουργικότητα των 3’ UTRs σε αλληλεπίδραση με το πρωτεϊνικό οπλοστάσιο του κυττάρου μελετήθηκε in vitro με συστήματα αναφοράς λουσιφεράσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα τρία μετάγραφα υπόκεινται σε διαφορετική ρύθμιση σύμφωνα με το μήκος του 3’ UTR, και βρέθηκαν ρυθμιστικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μεταγράφων. Η γονιδιακή οργάνωση των δύο ισομορφών και οι συντενικές σχέσεις μεταξύ των Sparus aurata, Dicentrarchus labrax, Danio rerio, Gadus morhua, Gasterosteus aculeatus, Oryzias latipes και Tetraodon nigroviridis μελετήθηκαν. Τα γονιδία της MLC2A και MLC2B έχουν 5 και 6 εξόνια αντίστοιχα σε όλους τους οργανισμούς που μελετήθηκαν. Η οργάνωση των εξονίων-ιντρονίων είναι περισσότερο όμοια στους πιο εξελικτικά συγγενικούς οργανισμούς, το οποίο επιβεβαιώνεται από το φυλογενετικό δέντρο, πιθανότατα υποδεικνύοντας διαφορετικές εξελικτικές πορείες για τις δύο ισομορφές της MLC2. Διαφορετικά πρότυπα έκφρασης των δύο ισομορφών της MLC2 κατά τη μυογένεση σε πρωτογενείς καλλιέργειες μυϊκών κυττάρων τσιπούρας και σε αναπτυσσόμενες νύμφες, και έπειτα από τη χορήγηση αυξητικής ορμόνης σε νεαρά άτομα, έδειξαν ότι οι δύο ισομορφές της MLC2 της τσιπούρας είναι παράλογα που που έχουν υποστεί κατανομή των λειτουργιών μεταξύ των αντιγράφων (subfunctionalization).Οι διαδικασίες ανάπτυξης και αύξησης του λευκού μυός συμβαίνουν μέσω γενονότων υπερπλασίας και υπερτροφίας που ρυθμίζονται από αρκετούς ρυθμιστικούς και ορμονικούς παράγοντες. Αλλαγές στον αριθμό και μέγεθος των μυϊκών κυττάρων (muscle cellularity) έδειξαν ότι η ανάπτυξη του λευκού μυϊκού συστήματος της τσιπούρας οφείλεται σε ξεχωριστές φάσεις υπερπλασίας και υπερτροφίας. Οι δύο ισομορφές της MLC2 είχαν διαφορετικό πρότυπο έκφρασης ανάλογα με τη διαδικασία: η MLC2A χαρακτήρισε τη σύνθεση νέων ινών στις ζώνες αύξησης, εμφανίστηκε νωρίς στην ανάπτυξη και συσχετίστηκε με μυογενετικούς παράγοντες ενώ η MLC2B αυξήθηκε μόνο κατά την υπερτροφία σε ύστερο αναπτυξιακό στάδιο και συσχετίστηκε με μυϊκά δομικά γονίδια. Η επίδραση των συνθηκών εκτροφής στην πλαστικότητα των δύο ισομορφών της MLC2 προσδιορίστηκε σε νύμφες και νεαρά άτομα τσιπούρας που προέρχονται από την ίδια παρτίδα αυγών και εκτράφηκαν σε συνθήκες εντατικής καλλιέργειας ή μεσόκοσμου, όπως επίσης και σε νεαρά άτομα τσιπούρας που εκτράφηκαν σε συνθήκες εμπορικής ιχθυοκαλλιέργειας και υπέστησαν διαλογή κατά μέγεθος με διαλογείς αυξανόμενου μεγέθους. Τα αποτελέσματα του πειράματος των συνθηκών εκτροφής έδειξαν ότι οι εκτρεφόμενες στο μεσόκοσμο νύμφες αυξήθηκαν περισσότερο και είχαν αυξημένη έκφραση της MLC2 σε σχέση με τις νύμφες που εκτράφηκαν σε συνθήκες εντατικής καλλιέργειας. Στο δεύτερο πείραμα, η σωματική αύξηση των νεαρών ατόμων βελτιώθηκε ελάχιστα. Η αναλογία MLC2A/MLC2B συσχετίστηκε σημαντικά με την αύξηση στα νυμφικά και πρώιμα ενήλικα στάδια.Δεδομένης της προσαρμοστικότητας της έκφρασης των δύο ισομορφών της MLC2 στην πρώιμη ανάπτυξη της τσιπούρας, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής παρέχουν ισχυρέ αποδείξεις ότι οι ισομορφές της MLC2 είναι δείκτες πρώιμης αύξησης.