Καθορισμός της γενετικής σύστασης πληθυσμών ειδών του γένους Brachionus με χρήση μοριακών δεικτών

Abstract

The Brachionus rotifers are small zooplanktonic organisms that can be found in continental water bodies. They are economically important organisms, since they are commonly used as live food for fish larvae in the aquaculture industry. They also have an interesting life cycle (cyclic parthenogenesis, formation of resistant resting eggs) and they are characterised by the presence of cryptic species. Thus, many research efforts have been devoted to their study. As a result, the genus Brachionus has been characterised as the “guinea pig of the rotifers”. The presence of cryptic species in Brachionus rotifers necessitates the use of genetic characterisation methods for the study of their populations. Up to date, a significant number of Brachionus cryptic species have been found following analyses of nucleotide sequence variation in the COI and ITS1 regions. Most of these cryptic taxa form the “B. plicatilis species complex”. With the description of the B. plicatilis species complex it became evident that many of its members are used in hatcheries and body size is an inaccurate criterion to describe the cultured strains at the level of species. Currently, the best way to identify a rotifer of the B. plicatilis complex is by studying its sequence in one of the two previous markers. However, it is difficult to use this approach to study Brachionus populations, because of the excessive number of samples that are needed to be analysed. It is therefore necessary to develop a method that will allow the fast and reliable genetic characterisation of rotifer samples. On the other hand, there is growing evidence of additional cryptic species, both within and outside the B. plicatilis complex. New genetic markers could help us reconstruct more robust phylogenies and determine more accurately the actual number and the evolutionary relationships of the Brachionus cryptic species. In this dissertation, a considerable number of COI sequences deposited in the GenBank was used to develop an RFLP method for the genetic characterisation of the cryptic Brachionus rotifers. Sequencing analysis has shown that most of the known cryptic species/biotypes are included in the examined data set, whereas the presence of new cryptic species is also supported. Using these sequences, a detailed restriction map was constructed. Additionally, Brachionus-specific primers for the 16S rRNA mitochondrial region were designed and employed to the studied rotifer populations to yield a collection of 16S rRNA sequences. Sequencing analysis revealed that the 16S rRNA marker is superior to the COI, when deep divergences are studied in Brachionus rotifers. Thus, by combining these two markers a more robust mitochondrial-based Brachionus phylogeny can be inferred. The 16S rRNA sequences were also used to develop a second restriction map. The data from both the COI and 16S maps were used successfully to genetically characterise rotifers from the studied populations.

Τα τροχόζωα του γένους Brachionus είναι μικροσκοπικοί ζωοπλαγκτικοί οργανισμοί ηπειρωτικών υδάτινων μαζών. Η οικονομική τους σημασία, με τη χρησιμοποίησή τους ως τροφή στην καλλιέργεια αρκετών ειδών ψαριών, έχει προωθήσει σημαντικά τη μελέτη τους. Το γεγονός αυτό, σε συνδυασμό με τις ιδιαιτερότητες του κύκλου ζωής τους (κυκλική παρθενογένεση, σχηματισμός ανθεκτικών αβγών διάπαυσης), αλλά και την αποκάλυψη της παρουσίας κρυπτικών ειδών στο γένος, έχουν οδηγήσει τα τροχόζωα Brachionus στο επίκεντρο αρκετών ερευνητικών προσπαθειών, τουλάχιστο σε μεγαλύτερο βαθμό σε σχέση με άλλα γένη του φύλου Τροχόζωα. Δικαιολογημένα λοιπόν, το γένος Brachionus χαρακτηρίζεται ως το «ινδικό χοιρίδιο των τροχοζώων». Η παρουσία κρυπτικών ειδών στο γένος Brachionus επιβάλλει τη χρησιμοποίηση μεθόδων γενετικής ταυτοποίησης στο πλαίσιο της μελέτης των πληθυσμών τους. Η γενετική ταυτότητα ενός σημαντικού αριθμού κρυπτικών ειδών Brachionus είναι μέχρι στιγμής γνωστή σε δύο γενετικούς δείκτες (COI & ITS1). Η περιγραφή του συμπλέγματος κρυπτικών ειδών B. plicatilis έδειξε ότι αρκετά από τα μέλη του συμπλέγματος καλλιεργούνται στα εκκολαπτήρια και ότι η διάκρισή τους με βάση το μέγεθος του σώματος δε μπορεί να οδηγήσει στον ακριβή προσδιορισμό του καλλιεργούμενου είδους ή βιοτύπου. Η συνηθέστερη μέθοδος για την ταυτοποίηση ενός τροχοζώου του συμπλέγματος B. plicatilis αφορά τη μελέτη της ακολουθίας πρωτοδιάταξής του σε κάποιον από τους δύο παραπάνω γενετικούς δείκτες. Ωστόσο, η συγκεκριμένη προσέγγιση είναι δύσκολο να εφαρμοστεί στην περίπτωση που μελετώνται πληθυσμοί των τροχοζώων Brachionus, λόγω του μεγάλου αριθμού των δειγμάτων που χρειάζεται να ταυτοποιηθούν. Επομένως, προκειμένου να γίνει καθορισμός της γενετικής σύστασης πληθυσμών ειδών του γένους Brachionus, χρειάζεται να αναπτυχθούν πρώτα οι γενετικές εκείνες μέθοδοι που θα επιτρέψουν το γρήγορο και αξιόπιστο γενετικό χαρακτηρισμό των δειγμάτων του πληθυσμού. Επιπλέον, υπάρχουν δεδομένα που υποστηρίζουν την παρουσία και άλλων κρυπτικών ειδών, τόσο εντός όσο και εκτός του συμπλέγματος B. plicatilis. Η χρησιμοποίηση νέων γενετικών δεικτών, σε συνδυασμό με τους ήδη υπάρχοντες, μπορεί να οδηγήσει στην απόκτηση μιας πιο ολοκληρωμένης εικόνας όσον αφορά τον ακριβή αριθμό των κρυπτικών ειδών Brachionus, αλλά και των σχέσεων μεταξύ τους. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε ένας μεγάλος αριθμός κατατεθειμένων στην GenBank ακολουθιών COI, προκειμένου να αναπτυχθεί η μέθοδος RFLP στο συγκεκριμένο γενετικό δείκτη. Η ανάλυση των ακολουθιών έδειξε ότι αυτές περιλαμβάνουν την πλειονότητα των μέχρι στιγμής γνωστών κρυπτικών ειδών/βιοτύπων Brachionus, ενώ επίσης υποστηρίζεται η παρουσία και νέων. Με βάση αυτές τις ακολουθίες κατασκευάστηκε ένας «χάρτης περιορισμού» για τη μιτοχονδριακή περιοχή COI, τα δεδομένα του οποίου χρησιμοποιήθηκαν για το γενετικό χαρακτηρισμό δειγμάτων τροχοζώων κρυπτικών ειδών/βιοτύπων Brachionus στους πληθυσμούς που μελετήθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής.