Βιοχημική και μοριακή ανάλυση των πεπτιδύλ-προλύλ cis-trans ισομερασών στα φυτά και στους μικροοργανισμούς

Abstract

The cis/trans isomerization of the peptide bond preceding proline is an intrinsically slow processes catalyzed by Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerases (PPIases, E.C. 5.2.1.8). There are three well studied families of PPIases cyclophilins, FK506 Binding Proteins and parvulins, whilst recently PTPA (Phosphatase Two A Phosphatase Activator) was found to exhibit PPIase activity. PPIases are ubiquitous enzymes involved in various biological processes. Interestingly, eukaryotic parvulins compromise the only family having essential members for the survival of the organism they belong. The aim of this thesis is the biochemical and molecular analysis of parvulins in the model legume Lotus japonicus as well in the microsymbiot Mesorhizobium loti.In L. japonicus there are three parvulins designated as LjPar1, LjPar2 and LjPar3. LjPar1 and LjPar2 represent single domain parvulins homologous to hPIN1 and hPar14 from human respectively. LjPar3 represents a novel multidomain parvulin, apparently present only in plants, that contains an active carboxyl-terminal sulfurtransferase domain. All three parvulins exhibit PPIase activity with different substrate specificities depending on the amino acid amino terminal to proline. Spatial localization of LjPar2 and LjPar3 gene expression during nodule development was determined by RNA-RNA in situ hybridization. Subcellular localization of LjPar-enhanced Yellow Fluorescence Protein (eYFP) fusions expressed in Arabidopsis leaf epidermal cells revealed that LjPar1- and LjPar2-eYFP fusions were localized in the cytoplasm and in the nucleus, in contrast to LjPar3-eYFP, which was clearly localized in plastids. The interaction network of L. japonicus parvulins was explored by a yeast two hybrid library screening. For LjPar1 99 clones were initially isolated, only 22 of them were able to interact with LjPar1 but also were autoactivating the reporter genes. In the screening with LjPar2 only 8 different clones were isolated and all of them presented to autoactivate the reporter genes. In the case of LjPar3, 64 clones were isolated and one of them was able to interact with LjPar3 without autoactivating the reporter genes. Finally, for the functional characterization of plant parvulins we generated transgenic lines of L. japonicus with an RNAi (RNA interference) construct that expresses hairpin double-stranded RNA for each parvulin to induce sequence specific RNA silencing. For LjPar1 we obtained 23 independent transgenic lines in two of which the transcript levels of LjPar1 were reduced more than 95%. Accordingly, for LjPar2 we obtained 19 transgenic lines in 6 of which the transcript levels of LjPar2 were reduced more than 95% and for LjPar3 out of 10 transgenic lines 3 exhibited a reduction in the transcript levels of LjPar3 more than 90%.Furthermore, a co-precipitation approach and analysis with LC-MS-MS was undertaken in order to identify interactions of MlPar1 with proteins from M. loti.

Η cis/trans ισομερείωση των πεπτιδικών δεσμών που προηγούνται μιας προλίνης είναι μια αργή διαδικασία που καταλύεται τις Πεπτιδύλ–Προλύλ cis/trans Ισομεράσες (PPIases, Peptidyl–Prolyl cis/trans Isomerases, E.C. 5.2.1.8). Μέχρι σήμερα έχουν μελετηθεί τρείς οικογένειες ΡΡΙασών οι κυκλοφιλίνες (Cyclophilins), οι FKBPs (FK506 Binding Proteins) και οι παρβουλίνες (Parvulins) ενώ πρόσφατα βρέθηκε ότι έχει δράση ΡΡΙάσης και η PTPA (Phosphatase Two A Phosphatase Activator). Οι PPIάσες είναι ένζυμα καθολικής διάδοσης, εμπλέκονται σε πληθώρα κυτταρικών διεργασιών ενώ μέλη των ευκαρυωτικών παρβουλινών είναι απαραίτητες για την βιωσιμότητα του οργανισμού από τον οποίο προέρχονται. Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε με σκοπό τη βιοχημική και μοριακή ανάλυση ΡΡΙασών που ανήκουν στην οικογένεια των παρβουλινών και προέρχονται από το φυτικό μοντέλο Lotus japonicus αλλά και από τον συμβιωτή του Mesorhizobium loti.Στο L. japonicus εντοπίστηκαν και μελετήθηκαν τρεις παρβουλίνες οι LjPar1, LjPar2 και LjPar3. Οι LjPar1 και LjPar2 αποτελούνται μόνο από τη δομική περιοχή παρβουλίνης και είναι ομόλογες των hPIN1 και hPar14 από τον άνθρωπο αντίστοιχα. Η LjPar3 αντιπροσωπεύει μια νέα οικογένεια παρβουλίνων που έχουν μια επιπλέον ενεργή δομική περιοχή ροδανάσης/θειομεταφοράσης και εντοπίζονται κυρίως στους φυτικούς οργανισμούς. Οι τρεις παρβουλίνες παρουσιάζουν in vitro ενζυμική δραστηριότητα ΡΡΙάσης έναντι συνθετικών τετραπεπτιδίων με διαφορετικές σταθερές εξειδίκευσης που οφείλονται στο αμινοξύ που προηγείται της προλίνης. Με τη μέθοδο RNA-RNA in situ υβριδισμού μελετήθηκε ο χώρο-χρονικός εντοπισμός των μεταγραφημάτων των LjPar2 και LjPar3 σε αναπτυσσόμενα φυμάτια. Με τη χρήση χειμερικών πρωτεϊνών LjPar-eYFP (enhanced Yellow Fluorescence Protein) βρέθηκε ότι οι LjPar1 και LjPar2 εντοπίζονται στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα επιδερμικών φύλλων Arabidopsis ενώ η LjPar3 εντοπίζεται στα πλαστίδια. Η διερεύνηση του δικτύου αλληλεπιδράσεων των παρβουλινών του L. japonicus πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο των δύο υβριδίων σε κύτταρα ζύμης. Στη σάρωση βιβλιοθήκης από φυμάτια και ρίζες του L. japonicus χρησιμοποιώντας την LjPar1 ως δόλωμα απομονώθηκαν 99 κλώνοι, από αυτούς 22 ικανοί να διατηρήσουν την αλληλεπίδραση στον επανέλεγχο ενώ ταυτόχρονα παρουσιαζόταν και το φαινόμενο της αυτόνομης ενεργοποίησης των γονιδίων αναφοράς. Αντίστοιχα, για την LjPar2 απομονώθηκαν 8 διαφορετικοί κλώνοι που παρουσίαζαν έντονα το φαινόμενο της αυτόνομης ενεργοποίησης. Τέλος, στην σάρωση με την LjPar3 απομονώθηκαν 64 κλώνοι από τους οποίους ένας κλώνος, που εντοπίστηκε 4 φορές, αλληλεπιδρά με την LjPar3, χωρίς να ενεργοποιεί αυτόνομα τα γονίδια αναφοράς. Παράλληλα, για τη μελέτη της λειτουργίας των φυτικών παρβουλινών πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός υποκοτυλίων του L. japonicus με σκοπό τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών στα οποία πραγματοποιείται αποσιώπηση των γονιδίων των παρβουλινών. Για την LjPar1 ελέχθησαν 23 μετασχηματισμένα φυτά και 2 σειρές από αυτά να παρουσίασαν μείωση των επιπέδων μεταγραφημάτων της LjPar1 σε ποσοστό μεγαλύτερο από 95%. Αντίστοιχα για την LjPar2 μελετήθηκαν 19 φυτά και σε 6 σειρές παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων μεταγραφημάτων της LjPar2 σε ποσοστό μεγαλύτερο από 95%. Τέλος, για την LjPar3 μελετήθηκαν 10 φυτά και σε 3 σειρές παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων μεταγραφημάτων της LjPar3 σε ποσοστό μεγαλύτερο από 90%.Ταυτόχρονα, με σκοπό τον εντοπισμό πρωτεϊνών που πιθανά αλληλεπιδρούν με την παρβουλίνη MlPar1 του M. loti, πραγματοποιήθηκε ανάλυση με υγρή χρωματογραφία – φασματομετρία μάζας (LC-MS-MS) πρωτεϊνών του M. loti που προέκυψαν από συγκαθίζηση τους με την MlPar1.