CD8 T-κυτταρική απάντηση έναντι των αντιγόνων της σαρβινίνης και της τελομεράσης στον καρκίνο του πνεύμονα

Abstract

OBJECTIVE Cytolytic CD8+ T cells are one of the major effector mechanisms against tumor specific immune response. Their study, using modern techniques of cellular immunity, is a subject of interest regarding the understanding of failure of immunosurveillance to control tumor growth, and their involvement in cancer immunotherapy. The purpose of this study was to detect CTL clones against epitopes of survivin, survivin-2B and hTERT in peripheral blood and TILs in patients with lung cancer, and to quantitatively and qualitatively characterize these clones in comparison with the corresponding clones, which may be detected in healthy subjects by using highly sensitive techniques. MATERIAL Peripheral blood was collected from 20 patients with primary lung cancer (at diagnosis) (17 men and 3 women, mean age 56 ± 2.3 years) and 5 healthy donors (5 men, mean age 67.1 ± 9.9 years). In 5 out of 9 patients with lung cancer, peripheral blood also collected 3 weeks after 3-6 cycles of platinum. Also, tumor tissue was collected and TILs were isolated from patients who underwent surgery. METHODS Cytolytic CD8+ T cells against specific peptide of survivin, survivin-2B and telomerase were detected after in vitro amplification of several hundred microcultures under limiting dilution conditions. The detection of these cells was achieved by HLA-multimer flow cytometric technology. The frequency of antigen specific CD8 T cells was estimated by the use of Poisson distribution analysis for rare events, corrected by Bernoulli. CD8 lines were isolated and characterized phenotypically on the basis of extracellular markers that define the differentiation stage. CD8 clones from patients and normal individuals were isolated by magnetic sorting, and characterized phenotypically and functionally regarding their lytic capacity, cytokine production and affinity of their TCR. RESULTS (a) in peripheral blood, anti-survivin or anti-survivin-2B specific CTL clones were not detected in patients, and in none of the healthy individuals, while (B) in both groups specific CTLs against peptides of telomerase, hTERT.A2 and hTERT.A24, were detected, however, the CTL frequency in patients showed higher variation. (c) The frequency of circulating peptide-specific pCTLs appeared to be unaffected by radio- and chemotherapy. (d) Compared to CTLs of healthy individuals, specific CTL clones of cancer patients showed similar qualitative and quantitative characteristics. (e) Anti-EBV CD8 T cells were detected in cancer patients at similar levels to those of healthy individuals. (f) In TILs, specific CD8 T cell response against tumor antigens was undetectable, however, specific CTL clones against viral peptides were identified. CONCLUSION The absence of detectable CD8 T cell responses against peptides of surviving, opposed to the presence pCTLs against peptides of hTERT, raises important questions regarding the immunogenicity of survivin and the use of its peptides in cancer immunotherapy, including lung cancer. The variation in frequency of detectable specific cytolytic clones and the pCTL functional differences between patients and normal subjects could represent key factors in understanding the immune response in clinical trials and the design of improved cancer immunotherapy.

ΣΚΟΠΟΣ Τα CD8+ κυτταρολυτικά Τ-κύτταρα αποτελούν έναν από τους σημαντικότερους δραστικούς μηχανισμούς της ειδικής έναντι των όγκων ανοσιακής απάντησης. Η μελέτη τους, με τη βοήθεια των σύγχρονων τεχνικών ελέγχου της κυτταρικής ανοσίας, αποτελεί θερμό αντικείμενο έρευνας, τόσο στο πλαίσιο κατανόησης της αποτυχίας της ανοσοεπιτήρησης να ελέγξει την ανάπτυξη των όγκων, όσο και υπό το φως των προσπαθειών επαγωγής τους με στόχο την ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η αναζήτηση κυτταρολυτικών CD8+ Τ κλώνων έναντι επιτόπων των πρωτεϊνών σαρβιβίνη, σαρβιβίνη-2Β και hTERT στο περιφερικό αίμα και σε TILs ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα καθώς και ο ποσοτικός και ποιοτικός χαρακτηρισμός τους σε σύγκριση με αντίστοιχους κλώνους, που ενδεχομένως ανιχνεύονται σε υγιή άτομα, με τη χρήση τεχνικών μεγάλης ευαισθησίας. ΥΛΙΚΟ Συλλέχθηκε περιφερικό αίμα από 20 ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα (κατά την διάγνωση της νόσου) (17 άνδρες και 3 γυναίκες, μέσης ηλικίας 56±2.3 ετών) και 5 υγιείς δότες (5 άνδρες, μέσης ηλικίας 67.1±9.9 ετών). Σε 5 από τους 9 ασθενείς με μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα περιφερικό αίμα συλλέχθηκε επίσης 3 εβδομάδες μετά από 3-6 κύκλους θεραπείας με πλατίνα. Επίσης, σε όσους ασθενείς υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση έγινε συλλογή καρκινικού ιστού και απομόνωση TILs. ΜΕΘΟΔΟΙ Κυτταρολυτικά CD8+ Τ κύτταρα ειδικά έναντι πεπτιδίων των αντιγόνων σαρβιβίνης, σαρβιβίνης-2Β και τελομεράσης ανιχνεύθηκαν έπειτα από in vitro ενεργοποίηση περισσοτέρων των διακοσίων μικροκαλλιεργειών υπό συνθήκες φθίνουσας συγκέντρωσης. Η ανίχνευση της παρουσίας αυτών των κυττάρων έγινε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας φθοριομένα HLA-πολυμερή. Η συχνότητα των αντιγονοειδικών CD8+ Τ κυττάρων υπολογίστηκε με βάση την κατανομή Poisson διορθωμένη για σπάνια φαινόμενα κατά Bernoulli. Απομονώθηκαν CD8 γραμμές και χαρακτηρίστηκαν φαινοτυπικά με βάση εξωκυττάριους δείκτες που καθορίζουν το στάδιο διαφοροποίησης. Από τις CD8 γραμμές ασθενών και μαρτύρων απομονώθηκαν κλώνοι με μαγνητικό διαχωρισμό που χαρακτηρίστηκαν φαινοτυπικά και λειτουργικά ως προς την λυτική τους ικανότητα, παραγωγή κυτταροκινών και την συγγένεια του TCR. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (α) Στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα κατά την διάγνωση και υγιών ατόμων δεν ανιχνεύθηκαν CTLs ειδικά έναντι των πεπτιδίων Surv.A2 και Surv.A24 ενώ (β) και στις δύο ομάδες ανιχνεύθηκαν CTLs ειδικά έναντι των πεπτιδίων της τελομεράσης, hTERT.A2 και hTERT.A24 αλλά στους ασθενείς η συχνότητα αυτή, παρουσίαζε μεγαλύτερη διακύμανση. (γ) Η συχνότητα των αντιγονοειδικών πληθυσμών στους ασθενείς φάνηκε ότι δεν επηρεάστηκε από τη ράδιο- και χημειοθεραπεία. (δ) Σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα, αντιγονοειδικά CD8+ Τ κύτταρα ασθενών, εμφάνισαν παρόμοια λειτουργικά χαρακτηριστικά. (ε) Ασθενείς με καρκίνο είχαν αντι-EBV CD8+ Τ κύτταρα στα ίδια επίπεδα με αυτά των φυσιολογικών ατόμων. (στ) Στα TILs ασθενών, δεν ανιχνεύθηκε CD8+ Τ απάντηση έναντι κανενός πεπτιδίου αντιγόνων των όγκων παρά μόνο έναντι ιικών πεπτιδίων.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η μη ανίχνευση CD8 Τ απαντήσεων έναντι πεπτιδίων της σαρβιβίνης σε αντίθεση με την παρουσία pCTLs έναντι πεπτιδίων της hTERT, θέτει σημαντικά ερωτήματα ως προς την ανοσογονικότητα της σαρβιβίνης και την χρήση της στην ανοσοθεραπεία του καρκίνου γενικότερα και όχι μόνο του καρκίνου του πνεύμονα. Η διακύμανση στην συχνότητα ανίχνευσης ειδικών κλώνων και τα ποιοτικά χαρακτηριστικά των pCTLs των ασθενών και φυσιολογικών ατόμων, θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν καθοριστικούς παράγοντες για την κατανόηση της ανοσιακής απάντησης των μέχρι τώρα κλινικών μελετών και στο σχεδιασμό βελτιωμένων ανοσοθεραπευτικών πρωτοκόλλων.