Μελέτη ιστονικών τροποποιήσεων με βιοχημικές, βιοφυσικές και μορφολογικές μεθόδους

Abstract

Nuclear envelope vesicles associated with fragments of peripheral heterochromatin were found to contain multiple histone-modifying activities. In vitro pull down assays revealed that one of these activities in cells arrested at G0 (chicken erythrocytes) binds specifically to heterochromatin protein 1β and phosphorylates histone H3 at threonine 3. In a western blot analysis, Haspin kinase (which has been previously identified as the major H3T3 specific kinase) was not found to be present in the pull down precipitate. By employing in vitro phosphorylation assays using HP1 precipitates of interphase and mitotic HeLa cell extracts we aimed at identifying other histone kinases potentially recruited by HP1 in distinct cell cycle phases. Moreover, we examined the possibility of other than H3T3 phosphorylation targets on the histone H3 molecule. As it turns out HP1β interacts with enzymatic activities that phosphorylate wtH3 as well as T3- and S10-mutants derived from all cell cycle phases, although the phosphorylation is predominant in mitotic fractions. To denote candidate interacting mitotic kinases we used specific antibodies in a western blot analysis. Interestingly, a major mitotic histone kinase, Aurora B, which phosphorylates S10H3 and S28H3 during mitosis, was found to interact with the entire HP1 molecule mainly through the CSD domain, to a lesser extent with the CD domain, while there seems to be no interaction with the hinge region. Furthermore, using recombinant proteins (HP1 and Aurora B) we showed that Aurora B interacts directly with the entire HP1 mainly through the CSD domain, less with the CD domain, while it seems to be no interaction with the hinge region. Finally, we used an HP1 mutant, where the α2-helix of the CSD domain was eliminated, and we demonstrated that this structural difference between the CSD and the CD (i.e. the α2-helix of the CSD domain) plays an important role in the interaction between HP1 and Aurora B.

Κλάσματα πυρηνικών φακέλων περιφερικής ετεροχρωματίνης (ΝΕΡΗ) που συνδέονται ισχυρά στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη περιλαμβάνουν πολλά ένζυμα που τροποποιούν τις ιστόνες. Μια από αυτές τις ενεργότητες σε κύτταρα «ακινητοποιημένα» στην G0 φάση (ερυθροκύτταρα όρνιθας) προσδένεται ειδικά στην ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 και φωσφορυλιώνει την ιστόνη Η3 στη θρεονίνη 3 in vitro. Με τη χρήση ειδικού αντισώματος για την κινάση Haspin (ένζυμο που φωσφορυλιώνει την Τ3Η3) και ανοσοαποτύπωση κατά western, δείξαμε ότι η κινάση αυτή δεν είναι Haspin. Προκειμένου να εξακριβώσουμε αν η Τ3Η3 αποτελεί μοναδικό στόχο αυτής της ΗΡ1-συνδεόμενης κινάσης σε κύτταρα που «διατρέχουν» τον κυτταρικό κύκλο πραγματοποιήσαμε δοκιμασίες in vitro φωσφορυλίωσης μετά από συγκατακρήμνιση με την ΗΡ1β με εκχυλίσματα χρωματίνης από μεσοφασικά και μιτωτικά κύτταρα HeLa. Διαπιστώθηκε ότι η ΗΡ1β αλληλεπιδρά με ένζυμα που φωσφορυλιώνουν όλες τις μορφές και τα μεταλλάγματα της Η3, αν και στην περίπτωση των μεσοφασικών κυττάρων, η φωσφορυλίωση της Η3 είναι πολύ μικρότερης έκτασης από ότι στη μίτωση. Για να επιβεβαιώσουμε ότι ΗΡ1β αλληλεπιδρά in vitro με μια από τις μιτωτικές κινάσες που είναι γνωστές από τη βιβλιογραφία, προχωρήσαμε στη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων αυτών με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων και ανοσοαποτύπωση κατά western. Διαπιστώσαμε ότι μία από τις κυριότερες μιτωτικές κινάσες, η Aurora B (η κινάση που φωσφορυλιώνει της S10 και σε μικρότερο βαθμό την S28 στη μίτωση), αλληλεπιδρά in vitro με την ΗΡ1β και μάλιστα ότι η κινάση αυτή συνδέεται κυρίως στην CSD της ΗΡ1β, σε μικρότερο βαθμό στην CD και καθόλου στην hinge (H) περιοχή της ΗΡ1β. Χρησιμοποιώντας ανασυδυασμένες πρωτεΐνες ΗΡ1β και Aurora B παρατηρήσαμε ότι η Aurora B αλληλεπιδρά άμεσα με την ακέραια ΗΡ1 κυρίως μέσω της CSD, λιγότερο μέσω της CD και σχεδόν καθόλου μέσω της περιοχής Η. Με τη χρήση ενός μεταλλάγματος της ΗΡ1β, στο οποίο είχε απαλειφθεί η α2 έλικα της περιοχής CSD, είδαμε ότι αυτή η δομική διαφορά στις δύο περιοχές (domains) της ΗΡ1 (δηλαδή η επιπλέον α2 έλικα του CSD) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση της ΗΡ1 με την παραπάνω κινάση.