Μοριακή ανίχνευση σε αρχειακό υλικό ανθεκτικών στις μακρολίδες στελεχών ελικοβακτηριδίου του πυλωρού και συσχετισμός με ιστολογικά δεδομένα ταξινόμησης κατά Sydney

Abstract

Helicobacter pylori (Hp) is a spiral, microaerobic, gram negative bacterium that infects gastric mucosa and is associated with different digestive diseases such as gastritis, peptic ulcer and neoplasia Many factors have been implicated as causes of treatment failure, and among them are certain genetic changes in terms of point mutations in the peptidyltransferase region of the domain V of the 23SrRNA of Hp, connected particularly with Clarithomycin resistance. The focus of this study was to evaluate these genetic changes in formalin-fixed paraffin embedded biopsies of Hp+ patients and to correlate them with various phenotypic changes expressed by Sydney’s classification parameters. A total of 150 Hp(+) biopsies-paraffin blocks were studied, taken from 75 patients divided in 2 groups: group A consisted of 25 Clarithromycin-resistant Hp(+) gastritis patients and group B consisted of 50 Hp(+) gastritis patients where successful eradication was achieved. Histologic classification was done according to Sydney criteria in bioptic material obtained before and after Hp(+) gastritis therapy. In most of the cases adequate quantity of DNA was extracted from archival bioptic material and analyzed by Real Time PCR, for the determination of point mutations in the 23S rRNA gene, responsible for Clarithromycin resistance. At the same time, a Real Time Quantitative PCR was also performed, in order to determine the absolute number of Hp bacteria per clinical sample. Our results revealed that in most of the Clarithomycin resistance cases of group A (16/25), certain point mutations at sites A2142C, A2142G and A2143G of the 23S rRNA had occurred. In some cases among group A patients, it was shown that mixed infections with both susceptible and resistant Hp strains had also occurred. Seven (7) cases from group A patients showed no mutations at all. A coexistence of mutated and wild type cases in 3 out of 50 Hp+ patients before therapy was observed in group B. A statistically significant association among almost all Sydney classification parameters (except atrophy) and genetic alterations in 23S rRNA of Hp were noticed. Furthermore, a strong correlation between genetic alterations and age of the patients was revealed, as well as between genetic alterations and the sites from where the biopsies were obtained. No correlation was observed between genetic status and absolute number of bacteria per clinical case as defined by Q-RT-PCR. Hp quantity correlates well with bacterial colonization as described histologically in Sydney classification. In conclusion, it seems that Hp is a rather genetically complicated microorganism, the biological and clinical behavior of which is largely affected by the host. Enhanced risk may be related to differences in expression of specific bacterial products, to variations in the host inflammatory response to the bacteria, or to specific interactions between host and microbes. Genes that are heterogeneously represented among Hp strains, however, may encode candidate virulence factors that influence the pathological course. Hp genome is largely characterized by genetic variability that permits the survival of the bacterium in a quite hostile environment. This genetic diversity affects the response of Hp in the followed treatment strategies, and alters the phenotype of the gastric mucosa environment, as this reflected in Sydney classification. So our findings in this study confirm the relevance of the Hp genotypes for the severity of gastric disease and the efficacy of antibiotic therapy to further prevent the (possible) progression to carcinogenesis or lymphomatogenesis.

Το Ελικοβακτηρίδιο του Πυλωρού (Επ) είναι ένας Gram(-) ελικοειδής μικροαερόφιλος μικροοργανισμός που αποικίζει επιφανειακά το γαστρικό βλεννογόνο και έχει συσχετισθεί αιτιολογικά με την πρόκληση γαστρίτιδας, πεπτικού έλκους και νεοπλασιών. Εμπόδια στην εκρίζωσή του αποτελούν διάφορες γενετικές αλλοιώσεις στο γονιδίωμα του μικροβίου, που το καθιστά ανθεκτικό σε μία σειρά θεραπευτικών σχημάτων με συγκεκριμένα αντιβιοτικά σκευάσματα και κυρίως στην Κλαριθρομυκίνη. Οι αλλοιώσεις αυτές αφορούν κατά κύριο λόγο σημειακές μεταλλάξεις στην αγκύλη της πεπτιδυλοτρανσφεράσης του 23S rRNA του μικροβίου. Σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη γενετικών αλλοιώσεων σε βιοπτικό υλικό σειράς ασθενών με Ελικοβακτηριδιακή λοίμωξη και η συσχέτισή τους με φαινοτυπικές αλλαγές του γαστρικού βλεννογόνου όπως αυτές ταξινομούνται ιστοπαθολογικά κατά Sydney (τροποποίηση Houston). Μελετήθηκαν 150 κύβοι παραφίνης Ελικοβακτηριδιακής γαστρίτιδας που αφορούσαν σε 75 ασθενείς χωρισμένους σε 2 ομάδες: η ομάδα Α που αποτελείτο από 25 ασθενείς με ανθεκτικότητα στη θεραπεία εκρίζωσης και η ομάδα Β αποτελούμενη από 50 ασθενείς στους οποίους επιτεύχθηκε εκρίζωση του μικροβίου. Η ιστολογική ταξινόμηση των περιστατικών έγινε σύμφωνα με την κατάταξη κατά Sydney σε αρχειακό βιοπτικό υλικό που πάρθηκε από κάθε ασθενή προ και μετά τη θεραπευτική αγωγή. Στη συνέχεια, γενετικό υλικό που εξάχθηκε από τις παραπάνω βιοψίες αναλύθηκε με τεχνική Real Time PCR. Παράλληλα στο ίδιο γενετικό υλικό έγινε προσδιορισμός του μικροβιακού φορτίου με τεχνική Quantitative-RT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στις περισσότερες (16/25) περιπτώσεις αντοχής στην Κλαριθρομυκίνη, επισυμβαίνει γενετική μεταβολή στις θέσεις A2142C, A2142G ή/και A2143G του 23S rRNA του Επ. Σε αρκετές περιπτώσεις συνυπάρχει μεταλλαγμένος και αμετάλλαχτος γονότυπος. Επτά (7) περιστατικά με ανθεκτικότητα δεν εμφάνισαν μεταλλάξεις στις παραπάνω θέσεις. Οι παρατηρούμενες γενετικές μεταβολές σχετίζονται σημαντικά (p<0,005) με το σύνολο σχεδόν των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών της ταξινόμησης Sydney (φλεγμονή, ενεργότητα, εντερική μεταπλασία, μικροβιακή παρουσία/αποικισμός) εκτός της ατροφίας. Ισχυρή συσχέτιση των γενετικών αλλοιώσεων παρατηρείται επίσης με την ηλικία και την περιοχή λήψης των βιοψιών, αλλά όχι με το φύλο των ασθενών και το μικροβιακό φορτίο όπως αυτό προσδιορίσθηκε με την Q-RT-PCR. Το τελευταίο σχετίζεται σημαντικά με την αποίκιση του μικροβίου όπως καταγράφεται στη ταξινόμηση Sydney. Συμπερασματικά φαίνεται ότι το Επ είναι ένας πολύπλοκος γενετικά οργανισμός, η συμπεριφορά του οποίου εξαρτάται εν πολλοίς και από τον ξενιστή. Το γενετικό του υλικό υφίσταται αλλοιώσεις που του επιτρέπουν να επιβιώνει μέσα στο εχθρικό περιβάλλον του στομάχου. Η παρουσία, δηλαδή, μεταλλάξεων επηρεάζει τόσο την ανταπόκρισή του στη χορηγούμενη φαρμακευτική αγωγή, όσο και τον φαινότυπο του μικροπεριβάλλοντος στο οποίο αναπτύσσεται, όπως αυτός καταγράφεται με την ταξινόμηση κατά Sydney. Φαίνεται λοιπόν, ότι η αλληλεπίδρασή του με τον ξενιστή δεν περιορίζεται μόνο σε τοπικές (in situ) αλλαγές της περιοχής αποικισμού, αλλά έχει γενικότερη επίδραση στη φυσιολογία του οργάνου και του οργανισμού γενικότερα.