Μελέτη της κλινικής σημασίας του ελεύθερου DNA (Free-DNA) στο περιφερικό αίμα σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις

Abstract

Circulating nucleic acids have been detected in the plasma of normal and diseased individuals since 1948 (cell free DNA, cell free RNA) and although the exact mechanisms that underlie the release of nucleic acid molecules in the peripheral circulation are not yet fully understood, cell death -through apoptosis and necrosis- is considered the major contributor of their rise in plasma according to findings reported mainly in cancer studies. Elevated cell free DNA levels may serve as an indicator of clinical severity in various pathological conditions such as autoimmune diseases, tissue injury and stroke and they have been correlated with the degree of tissue damage and the severity of post traumatic organ failure thus granting this new biomarker a potential prognostic value for risk stratification of trauma patients. The objective of this study was to investigate the clinical significance of cell-free DNA kinetics in patients with an acute myocardial infarction (AMI), in acute and chronic inflammation in exhaustive exercise and in juvenile rheumatoid arthritis. For the purposes of the present study, we developed a sensitive, reproducible and reliable quantitative real- time PCR (q RT-PCR) to measure cell-free DNA extracted from plasma. The method’s reproducibility and accuracy were assessed by calculating the interassay and intrassay coefficient of variation (CV%). Serial cell-free DNA level determinations were performed by quantitative Real-Time PCR in 47 AMI patients once daily during hospitalization (235 samples) and once in 100 healthy subjects (to establish the normal reference range). In addition, blood samples were obtained from 15 male athletes, participating in the ultradistance foot race of the 246 Km “Spartathlon”, in order to measure plasma interleukin-6 (IL-6), the serum inflammatory markers C-reactive protein (CRP) and serum amyloid A (SAA), and the tissue cell-free plasma DNA, before, at the end, and 48 h after the end of the race. Moreover, cell-free plasma DNA was measured along with C-reactive protein (CRP), creatine kinase (CK), and uric acid (UA) in 17 recreationally trained men participating in a 12-week resistance training regimen (8 resistance multi-joint exercises selected to stress the entire musculature). Finally, cell-free DNA was measured in children who have been diagnosed with juvenile arthritis upon diagnosis and after therapy administration. Statistical analysis of the measurements showed that cell-free DNA concentrations are significantly higher in patients throughout hospitalization compared to healthy subject levels (P<0.001). The median maximum cell-free DNA concentration was 3.5-fold higher (Mann Whitney P=0.0035) in 20/47patients with complicated post AMI course (1719.7, range 117.32-4996212.1 GenEq/ml plasma) compared with 27/47 patients without complications (492.9, range 56.43-4715.15 GenEq/ml plasma). Substantial differences exist between cell-free DNA concentrations measured on tpre (the day before the complication) and tc (the day the complication occurred) as well as tpost (the day after the complication) in group I whereby cell-free DNA rises significantly in tc and remains elevated in tpost (tpre vs. tc, 2.445 vs. 2.965, P=0.0171 and tpre vs. tpost 2.445 vs. 2.913, P=0.023). In addition, cell-free DNA could serve as a prognostic marker in heart failure (LVEF<40%). In the ‘Spartathlon’ paradigm of exhaustive exercise, IL-6, CRP, SAA and free plasma DNA levels markedly increased (by 8000-, 152- 108- and 10-fold, respectively) over the baseline at the end of the race. Cell-free DNA concentrations were elevated in AMI patients compared to healthy subjects, rise significantly when complications occur and have a potential clinical value in monitoring patient progress during hospitalization. Our findings suggest that the kinetics of cell-free DNA released in the peripheral circulation reflect the damage of the myocardium during the post AMI period. In the chronic inflammation model, cell-free DNA concentrations correlated with training volume whereas CRP, UA and CPK did not. Statistical analysis of the data obtained from the juvenile arthritis patients showed that significant differences exist between the patient and healthy control group. Cell-free DNA concentrations were elevated in AMI patients compared to healthy subjects, rise significantly when complications occur and have a potential clinical value in monitoring patient progress during hospitalization. This study also demonstrates that, after chronic excessive resistance exercise, plasma DNA concentrations increase in proportion to training load, suggesting that cell-free DNA may be a sensitive marker for overtraining-induced inflammation. In conclusion, cell-free DNA should be further studied to reveal its potential clinical use as a marker of the inflammatory processes, which play a role in the development of heart failure and death.

Ο κυτταρικός θάνατος (απόπτωση/νέκρωση) οδηγεί στην απελευθέρωση νουκλεϊκών οξέων (ελεύθερο DNA/ελεύθερο RNA) στην περιφερική κυκλοφορία του ατόμου. Τα ελεύθερα νουκλεϊκά οξέα έχουν ανιχνευθεί στο πλάσμα υγιών καθώς και ασθενών και προέρχονται από κύτταρα που καταστρέφονται στα πλαίσια της ομοιόστασης και της νόσου, αντίστοιχα. Τα επίπεδα του ελεύθερου DNA στο πλάσμα έχουν συσχετισθεί με τη βαρύτητα και την πρόγνωση διαφόρων παθολογικών καταστάσεων και μπορεί να αποτελέσουν δείκτη παρακολούθησης της ανταπόκρισης των ασθενών στη φαρμακευτική αγωγή, όπως για παράδειγμα στους ασθενείς με καρκίνο. Στόχο της παρούσας ερευνητικής προσπάθειας αποτέλεσε η διερεύνηση της κλινικής αξίας των επιπέδων του ελεύθερου DNA στο οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου, στην οξεία και χρόνια φλεγμονή και στην πρωτοδιάγνωστη νεανική αρθρίτιδα. Για το σκοπό αυτό, προτυποποίηθηκε μια ευαίσθητη και αξιόπιστη ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου στο σύστημα LightCycler (Roche) για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ελεύθερου DNA, το οποίο απομονώθηκε από δείγματα πλάσματος που συλλέχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας μελέτης. Αρχικά, προσδιορίστηκε η αξιοπιστία και η επαναληψιμότητα της μεθόδου (intra/inter- assay variation), ώστε να διαπιστωθεί η καταλληλότητά της για εφαρμογή στη συγκεκριμένη μελέτη. Στη συνέχεια, μετρήθηκε το ελεύθερο DNA στο πλάσμα 100 υγιών ατόμων προκειμένου να εξακριβωθεί το εύρος των φυσιολογικών τιμών. Έπειτα η μέθοδος εφαρμόστηκε για να μετρηθούν 235 δείγματα πλάσματος από 47 ασθενείς με οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου (ΟΕΜ) ως πρώτη εκδήλωση της στεφανιαίας νόσου καθώς και 15 δείγματα από αθλητές του «Σπάρταθλου» αγώνα δρόμου, 17 εθελοντών αθλούμενων και 39 παιδιών με πρωτοδιάγνωστη νεανική αρθρίτιδα. Στην ομάδα των καρδιοπαθών, πραγματοποιήθηκε διαδοχική συλλογή δειγμάτων περιφερικού αίματος κατά τη διάρκεια της νοσηλείας (1 δείγμα/ημέρα νοσηλείας), προκειμένου να απομονωθεί το ελεύθερο DNA. Παράλληλα, συλλέχθηκε ορός για τη μέτρηση της CPK και της cTnI (1 δείγμα/ημέρα νοσηλείας) και προσδιορίστηκε το κλάσμα εξώθησης αριστερής κοιλίας (LVEF) την 1η μετεμφραγματική ημέρα και κατά την έξοδο από τη νοσηλεία. Στην ομάδα των Σπαρταθλητών, έγινε λήψη ενός δείγματος περιφερικού αίματος πριν την έναρξη του αγώνα, κατά τον τερματισμό και 48 ώρες μετά τη λήξη του αγώνα, με στόχο την απομόνωση ελεύθερου DNA από το πλάσμα. Ταυτόχρονα, σε αυτή την ομάδα ατόμων, ελήφθησαν δείγματα ορού για τον προσδιορισμό των επιπέδων των περιφερικών παραγόντων φλεγμονής (IL-6, CRP και SAA). Οι εθελοντικά αθλούμενοι, υποβλήθηκαν σε ένα πρωτόκολλο πολυ-αρθρικών ασκήσεων αντιστάσεως μέσω προοδευτικά αυξανόμενου προπονητικού όγκου κατά τη διάρκεια τεσσάρων προπονητικών περιόδων (Τ1 έως Τ4). Η συλλογή των δειγμάτων περιφερικού αίματος, με στόχο την απομόνωση του ελεύθερου DNA, πραγματοποιήθηκε 96 ώρες μετά από την περίοδο ηρεμίας (Το) και μετά από κάθε προπονητική περίοδο. Ταυτόχρονα, σε αυτή την ομάδα ατόμων ελήφθησαν δείγματα ορού για τη μέτρηση της CRP, της CPK και του UA. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε πως το ελεύθερο DNA είναι σημαντικά αυξημένο στους ασθενείς με ΟΕΜ καθ’ όλη τη διάρκεια της νοσηλείας τους σε σχέση με τα επίπεδα που μετρήθηκαν στα υγιή άτομα (P<0.001). Επίσης, τα επίπεδα του υπό μελέτη δείκτη είναι σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς με επιπλοκές κατά τη νοσηλεία (1719.7, range 117.32-4996212.1 GenEq/ml plasma) σε σχέση με τα επίπεδα αυτών που είχαν ομαλή μετεμφραγματική πορεία έως την έξοδο από τη νοσηλεία (492.9,εύρος 56.43-4715.15 GenEq/ml plasma). Στην ομάδα των ασθενών με επιπλοκές, η συγκέντρωση του ελεύθερου DNA είναι υψηλότερη μεταξύ του ελεύθερου DNA της ημέρας μετά την επιπλοκή σε σχέση με τα επίπεδα που μετρήθηκαν την προηγούμενη και την επόμενη ημέρα (tpre vs. tc, 2.445 vs. 2.965, Ρ= 0.0171 and tpre vs. tpost 2.445 vs. 2.913, P=0.023). Επίσης, το ελεύθερο DNA φαίνεται πως έχει προγνωστική αξία στην περίπτωση της καρδιακής ανεπάρκειας (LVEF<40%). Στους αθλητές του «Σπάρταθλου» αγώνα, η στατιστική ανάλυση των μετρήσεων έδειξε πως το ελεύθερο DNA μπορεί να αποτελέσει αξιόπιστο δείκτη της οξείας φλεγμονής, καθώς μεταβάλλεται ανάλογα με τις πρωτεΐνες απόκρισης οξείας φάσης CRP και SAA. Στην περίπτωση των εθελοντικά αθλούμενων, στο μοντέλο της χρόνιας φλεγμονής, το ελεύθερο DNA φαίνεται να είναι πιο ευαίσθητος δείκτης της χρόνιας επιβάρυνσης καθώς μεταβάλλεται ανάλογα με τον προπονητικό όγκο. Αντιθέτως, οι μεταβολές της CRP και του UA δεν είναι ανάλογες του προοδευτικά αυξανόμενου προπονητικού όγκου. Στην ομάδα των παιδιών με πρωτοδιάγνωστη νεανική αρθρίτιδα διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα του ελεύθερου DNA μεταξύ των ασθενών και των υγιών παιδιών. Ωστόσο, στα παιδιά που προσήλθαν για επανεκτίμηση (έπειτα από θεραπεία), οι συγκεντρώσεις του ελεύθερου DNA είναι χαμηλότερες από αυτές της πρώτης μέτρησης (θέση πρώτης διάγνωσης). Συνεπώς, η ανάλυση των μετρήσεων έδειξε πως το ελεύθερο DNA μπορεί να αποτελέσει αξιόπιστο δείκτη της παρακολούθησης της ενδονοσοκομειακής πορείας των ασθενών με ΟΕΜ καθώς επίσης να χρησιμοποιηθεί και σαν δείκτης παρακολούθησης της έκτασης της φλεγμονής που προκαλείται από υπερπροπόνηση στους αθλητές. Τα δεδομένα της παρούσας εργασίας αποτελούν ισχυρές ενδείξεις για την αξία του υπό μελέτη δείκτη. Απαιτείται όμως μελέτη με μεγαλύτερου αριθμού δειγμάτων, ώστε να αναδειχθεί περαιτέρω η κλινική χρήση του ελεύθερου DNA.