Μελέτη των μοριακών μηχανισμών διαφοροποίησης in vitro

Abstract

3-D collagen cell culture system contrary to monolayer cell culture systems provide the ability to create experimental conditions similar to those that consists in human tissues. Our first aim was to detect and evaluate the expression of osteoblast specific genes such as collagen type Ι osteocalcin cbfa1 and bmp-7 in monolayer cultures against the 3-D collagen cell culture system in the MG-63 osteoblast like cells. The culture of MG-63 cells in the 3-D system induce the expression of cbfa1 after two weeks of cultivation and the expression of bmp-7 after four weeks of cultivation. Therefore, the 3-D collagen cell culture system constitute a reliable model for the research of osteoblast differentiation in vitro especially in the first stages when the cbfa1 and bmp-7 genes play a very important role. At the second part of our study we used the 3-D collagen cell culture system to study whether implantation of 3-D collagen systems can stimulate new bone formation in vivo. Approximately 5% up to 20% of bone fractures are followed by delayed or impaired healing process and such deregulation of the bone repair mechanism produces a number of clinical problems we investigated whether these 3 D collagen gels containing osteoblast like cells could be implanted into the microenvironment of a surgically produced bone defect and stimulate new bone formation. For this purpose we used the established model of the segmental diaphyseal limb defects in rabbits which do not require stabilization. We therefore showed that 3-D collagen gel containing MG-63 cells produced radiographic and histologic evidence of limb defects bridging new bone formation which resulted in bone union. On the contrary the experimental limbs which either were implanted with 3-D system (containing no MG-63 cells) or left empty (no 3-D implants) did not produce any evidence of bone healing process in the limb defects. Therefore, our preliminary data suggest that implants of 3-D collagen gels containing MG-63 osteoblast like cells can promote the bone healing process in vivo. Finally, at the third part of our study we used the 3-D collagen cell culture system in order to study the bone metastases that more than 90% of patients with advanced prostate cancer finally give. Recently osteoblasts cells known to express a member of the TNF ligand family receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) which is a membrane associated factor which interacts with OPG a soluble decoy receptor for RANKL preventing the establishment of osteolytic lesions in bone although it did not prevent the subcutaneous tumor growth in vivo. Herein, we documented that the presence of MG-63 osteoblast like cells in our 3D collagen culture system stimulated remarkably the expression of OPG in PC-3 prostate cancer cells. This enhancement of OPG expression was gene specific because Runx2 expression was not altered by this experimental procedure. These data suggest that epithelial to mesenchymal transition of prostate cancer cells during the process of invasion and metastasis is possibly not dependent on growth factors such as IGF-1 TGFβ1 and IL-6. In conclusion, enhancement of OPG expression of PC-3 cells when co-cultured with osteoblast like cells suggests that OPG may be a key player in the development of blastic reaction in bone metastasis microenvironment.

Σε αντίθεση με τις μονόστιβες καλλιέργειες κυττάρων το τρισδιάστατο σύστημα (3-D) καλλιέργειας κυττάρων μέσα σε ινίδια κολλαγόνου τύπου Ι έχει την ικανότητα να δημιουργεί πειραματικές συνθήκες παρόμοιες με εκείνες που παρουσιάζονται στους ιστούς. Στόχος του πρώτου μέρους ήταν η μελέτη της έκφρασης ειδικών οστεοβλαστικών γονιδίων όπως το κολλαγόνο τύπου Ι, η οστεοκαλσίνη, ο cbfa1 και η bmp-7 σε μονόστιβα συστήματα καλλιέργειας κυττάρων σε σύγκριση με την έκφρασή τους στο τρισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας σε οστεοβλαστικού τύπου κύτταρα (MG-63). Ανιχνεύθηκε και ποσοτικοποιήθηκε η έκφραση των γονίδιων σε επίπεδο m RNA. Η καλλιέργεια των κυττάρων MG-63 μέσα στο 3-D σύστημα προκάλεσε αύξηση στην έκφραση του cbfa1 μετά από δύο εβδομάδες καλλιέργειας και στην έκφραση της bmp-7 μετά από τέσσερις εβδομάδες καλλιέργειας. Έτσι, το τρισδιάστατο σύστημα καλλιέργειας κυττάρων σε κολλαγόνο τύπου Ι αποτελεί αξιόπιστο μοντέλο για την μελέτη της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών in vitro κυρίως στα πρώτα στάδια της διαφοροποίησης όπου τα γονίδια cbfa1 και bmp-7 παίζουν σημαντικό ρόλο. Κατά το δεύτερο μέρος χρησιμοποιήσαμε το τρισδιάστατο σύστημα κολλαγόνου για να μελετήσουμε τη γεφύρωση οστικών ελλειμμάτων στην διάφυση της κερκίδας κονίκλου που προκαλούνται χειρουργικά in vivo 5-20% των καταγμάτων εμφανίζουν καθυστερημένη πώρωση ή καταλήγουν σε ψευδάρθρωση. Προκειμένου να ελεγχθεί η ικανότητα του συστήματος να επιτύχει γεφύρωση πλήρωση οστικών ελλειμμάτων και πώρωση κατάγματος που υπό άλλες συνθήκες θα ήταν αδύνατη το τρισδιάστατο σύστημα με MG-63 τοποθετήθηκε σε οστικά ελλείμματα κερκίδας κονίκλων τύπου Νέας Ζηλανδίας. Η διαδικασία αυτή προκάλεσε την πλήρη γεφύρωση οστικών ελλειμμάτων με άριστης ποιότητας οστίτη ιστό. Η επιτυχής διαμόρφωση οστικού περιβάλλοντος ομοιάζων προς τον οστίτη ιστό επιτρέπει in vitro την ανάπτυξη ενός απλού στη μεθοδολογία και εφαρμογή συστήματος οστικής πώρωσης σε πειραματόζωα αλλά και τη δυνατότητα ανάπτυξης ανθρώπινων οστεοβλαστών εντός του τρισδιάστατου συστήματος και πιθανής μελλοντικής χρήσης σαν μέτρο για την θεραπεία της οστικής ψευδάρθρωσης γεφύρωσης οστικών ελλειμμάτων. Τέλος, στο τρίτο μέρος χρησιμοποιήσαμε το τρισδιάστατο σύστημα κολλαγόνου για να μελετήσουμε την οστική μετάσταση που περισσότερο από το 90% των ασθενών με ανεπτυγμένο καρκίνο του προστάτη δίνουν τελικά. Πρόσφατα οι οστεοβλάστες αποδείχτηκε ότι εκφράζουν ένα μέλος της οικογένειας των TNF γνωστό ως RANKL ο οποίος είναι ένας παράγοντας της μεμβράνης που αλληλεπιδρά με την OPG έναν διαλυτό δευτερεύον υποδοχέα για τον RANKL προλαβαίνοντας την εγκατάσταση οστεολυτικών αλλοιώσεων στα οστά παρότι δεν προλαμβάνει την υποδόρια αύξηση του όγκου in vivo. Στη παρούσα εργασία αποδείξαμε ότι η παρουσία των MG-63 οστεοβλαστικού τύπου κυττάρων στο 3-D σύστημα κολλαγόνου καλλιέργειας κυττάρων διεγείρει σημαντικά την έκφραση της OPG στα PC-3 προστατικά καρκινικά κύτταρα. Δείξαμε ότι οι παράγοντες που σχετίζονται με το μικροπεριβάλλον των οστών δεν έδειξαν καμία επίδραση στην έκφραση των Runx2 και OPG στα PC-3. Συμπερασματικά η αύξηση της έκφρασης της OPG στα PC-3 όταν συγκαλλιεργούνται με οστεοβλαστικού τύπου κύτταρα δείχνει ότι η OPG ίσως παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη οστεοβλαστικών αντιδράσεων στο μικροπεριβάλλον της οστικής μετάστασης.