Εκλεκτοί τροποποιητές (φυσικοί ή συνθετικοί) του υποδοχέα οιστρογόνων και η επίδρασή τους σε οιστρογονοεξαρτώμενα νοσήματα

Abstract

In mammals, estrogens have multiple effects ranging from control of reproductive, brain and immune function. They are considered to promote breast and endometrial cancer, whereas the lack of estrogens, during menopause, is correlated with increased risk of osteoporosis, coronary heart disease and neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and depression. Estrogens exert their effect via their intracellular receptors ERa and ERß, which have been detected in tissue targets for the hormone.Recent data, based on in vitro and in vivo experiments, demonstrate that synthetic and plant derived compounds (phytoestrogens) exhibit estrogenic or antiestrogenic activity. Their selective (estrogenic or antiestrogenic) biological action is tissue-specific and these substances are widely known as Selective Estrogen Receptor Modulators or SERMs. Phytoestrogens are considered to have beneficial effects on human’s health as they act as anticancer agents, prevent osteoporosis and lower the risk for coronary diseases. On the other hand synthetic analogs, such as tamoxifen and raloxifen, are currently used therapeutically for the treatment of breast cancer and osteoporosis.In the present study, we examined the estrogenic or antiestrogenic effect of plant extracts derived from Greek flora {Sideritis euboea, Sideritis cladestina, Marticaria chamomilla, Pimpinella anisum and Onobrychis ebenoides) and of substances isolated from the above extracts (ebenfuran I, II and III) as well as synthetically produced (deoxybenzynes NF7, NF4 and isoflavones NF6). For this purpose, we used the appropriate in vitro assays and in vivo model : 1) estrogen receptor binding affinity (RBA) assay, in cytosol extracted from breast cancer tissue or breast cancer cell-line MCF-7 2) stimulation of the differentiation and mineralisation of osteoblastic cell culture (MC3T3-E1 and KS483) by histochemical staining for alkaline phosphatase and by measuring ALP activity 3) induction, like antiestrogens, of the insulin growth factor binding protein 3 (IGFBP-3) in MCF-7 breast cancer cells 4) proliferation of cervical adenocarcinoma (HeLa) cells by use of MTT assay 5) in vivo model of ovariectomised rats, that have been estrogen deprived for at least 7 months (osteoporosis model), in which we measured a. stimulation of uterus proliferation, using as biological marker the uterus weigh and progesterone receptor levels b. promotion of apoptosis in brain, by detecting apoptotic protein bax and c. control of the lipid profile, by measuring HDL, LDL and triglyceride levels in serum.Our results demonstrate that ebenfurans I and II show estrogen binding activity. Ebenfìiran II exhibits the highest antiestrogenic activity in breast cancer cells, no stimulatory or even inhibitory effect on cervix adenocarcinoma cells and positive effect on osteoblasts. Ebenfuran I exhibits antiestrogenic effect in breast cancer cells and inhibitory effect on HeLa cells. The synthetic deoxybenzynes NF7, NF6 and the isoflavone NF6 show high antiestrogenic activity in breast cells while they inhibit cell proliferation on cervix adenocarcinoma cell line. On the other hand, plant extracts S.euboea, S.cladestina, M.chamomilla, P. anisum act as antiestrogens in breast and as estrogens in osteoblasts, whereas at high concentrations they show stimulatory effect on cervix adenocarcinoma HeLa cells. In vivo study of Onobrychis ebenoides demonstate that it doesn’t stimulate uterus proliferation has no apoptotic effect in brain and shows beneficial effect on LDL profile in rat’s serum. However, O. ebenoides extract exhibits estrogenic activity in breast cancer MCF-7 cell line. In this study, the in vitro assays and in vivo model used represent suitable systems, that works very well in assessing the estrogenic or antiestrogenic effects on test compounds and can be used for future evaluation of proportional compounds. The substances and plant extracts tested exhibit a potential SERM-like profile and lead us to further investigate their properties in vitro and in vivo.

Ο ρόλος των οιστρογόνων στη φυσιολογική λειτουργία, όχι μόνο του αναπαραγωγικού συστήματος της γυναίκας αλλά και των λοιπών συστημάτων του οργανισμού (π.χ. καρδιαγγειακό, κεντρικό νευρικό και οστά) έχει αποτελέσει εκτενές πεδίο έρευνας τα τελευταία έτη. Τα οιστρογόνα έχουν συσχετιστεί με πολλές παθήσεις, όπως καρκίνο του μαστού και του ενδομήτριου, οστεοπόρωση, καρδιαγγειακά νοσήματα και νευροψυχικές διαταραχές, έτσι ώστε να μιλούμε για θεραπευτική χρήση των οιστρογόνων σε πολλές από αυτές τις παθήσεις. Παράλληλα, η θεραπεία ορμονικής υποκατάστασης με οιστρογόνα κατά τη διάρκεια της εμμηνόπαυσης κρίνεται απαραίτητη, προκειμένου να μειωθούν τα δυσμενή, για τη γυναίκα, αποτελέσματα της απουσίας των οιστρογόνων.Τα τελευταία χρόνια, έχει εξακριβωθεί ένας μεγάλος αριθμός ουσιών, φυσικών ή συνθετικών, που φαίνεται να έχουν οιστρογονική ή αντιοιστρογονική δράση, μέσω του υποδοχέα των οιστρογόνων ER σε in vitro και in vivo πειράματα. Ορισμένες από τις ουσίες αυτές είναι φυτικής προέλευσης (φυτοοιστρογόνα), και απαντώνται σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης (π.χ. σόγια και δημητριακά), ενώ επιδημιολογικές μελέτες τις συνδέουν με προστατευτική δράση έναντι ορμονοεξαρτώμενων μορφών καρκίνου και οστεοπόρωση. Παράλληλα, έχουν συντεθεί αντίστοιχες ουσίες, όπως η ταμοξιφαίνη και η ραλοξιφαίνη, που χρησιμοποιούνται θεραπευτικά στον καρκίνο του μαστού και στην οστεοπόρωση. Οι ουσίες αυτές στο σύνολο τους ονομάζονται Εκλεκτικοί Τροποποιητές του Υποδοχέα Οιστρογόνων, καθώς η δράση τους είναι εκλεκτική και εξαρτάται από το είδος του ιστού και του υποδοχέα ER (ERa και ERß) με τον οποίο προσδένονται.Στην παρούσα διατριβή έγινε μια προσπάθεια να αξιολογηθούν, ως προς την οιστρογονική ή αντιοιστρογονική τους δράση σε διάφορα συστήματα, εκχυλίσματα, που παρασκευάζονται από φυτά της ελληνικής χλωρίδας (Sideritis euboea, Sideritis cladestina, Pimpinella anisum, Marticaria chamomilla και Onobrychis ebenoides), και καθαρές ουσίες που είτε έχουν απομονωθεί από τα φυτικά εκχυλίσματα (εμπενφουράνιο I, II και III), είτε έχουν παρασκευαστεί χημικά (δεοξυβενζοΐνες NF7, NF4 και ισοφλαβόνη NF6). Για το σκοπό αυτά χρησιμοποιήθηκαν οι κάτωθι πειραματικές διατάξεις : 1) Μελέτη της ικανότητας πρόσδεσης των ουσιών στον υποδοχέα οιστρογόνων ER σε κυτοσόλιο από δείγματα καρκίνου του μαστού και από κυτταροκαλλιέργειες καρκινικών κυττάρων μαστού MCF-7 2) Διερεύνηση της επίδρασης των υπό μελέτη ουσιών και εκχυλισμάτων στην αναστολή κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε καρκινικά κύτταρα τραχήλου της μήτρας HeLa 3) Μελέτη της πιθανής οιστρογονικής ή αντιοιστρογονικής δράσης των υπό μελέτη ουσιών και εκχυλισμάτων σε καρκινικά κύτταρα μαστού MCF-7 (με δείκτη την IGFBP3 πρωτεΐνη) και σε οστεοβλάστες MC3T3-E1 και KS483 (με δείκτη την αλκαλική φωσφατάση) 4) In vivo μελέτη των εκχυλισμάτων σε μοντέλο ωοθηκεκτομηθέντων επίμυων (μοντέλο οστεοπόρωσης) και διερεύνηση της δράσης αυτών στην μήτρα (με δείκτη το βάρος μήτρας και τα επίπεδα υποδοχέων προγεστερόνης σε αυτήν), στον εγκέφαλο (με δείκτη την αποπτωτική πρωτεΐνη bax) και στο λιπιδιμικό προφίλ στο ορό των επίμυων (με ποσοτικό προσδιορισμό της FIDL, LDL και τριγλυκεριδίων).Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα εμπενφουράνια έχουν την ικανότητα πρόσδεσης στον ER, με εξαίρεση το εμπενφουράνιο III. Το εμπενφουράνιο I έχει αντιοιστρογονική δράση στο μαστό και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό στα κύτταρα τραχήλου της μήτρας, ενώ το εμπενφουράνιο II παρουσιάζει αντιοιστρογονική δράση στο μαστό και οιστρογονική στα οστά και αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στη μήτρα. Οι συνθετικές δεοξυβενζοΐνες NF7, NF4 και ισοφλαβόνη NF6 έχουν ικανότητα πρόσδεσης στον ER, με ταυτόχρονη οιστρογονική δράση στο μαστό και δυνατότητα αναστολής κυτταρικού πολλαπλασιασμού στη μήτρα. Όσον αφορά στα εκχυλίσματα S.euboea, S.cladestina, P.anisum, M.chamomïlla, δρουν ως αντιοιστρογόνα στο μαστό και ως οιστρογόνα στα οστά, αλλά επάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στη μήτρα, σε υψηλές όμως συγκεντρώσεις. Με βάση την in vivo μελέτη, το εκχύλισμα O.ebenoides δεν προκαλεί υπερπλασία της μήτρας, ούτε επάγει αποπτωτικούς μηχανισμούς στον εγκέφαλο. Παράλληλα, έχει ευεργετική επίδραση στο λιπιδιμικό προφίλ, καθώς δεν αυξάνει την LDL χοληστερόλη στον ορό του αίματος των επίμυων. Εντούτοις, στα in vitro πειράματα έδειξε οιστρογονική δράση στα κύτταρα μαστού.Οι πειραματικές διατάξεις, που αναπτύχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή, αποτελούν ένα αξιόπιστο σύστημα αξιολόγησης ουσιών και εκχυλισμάτων ως προς την οιστρογονική/αντιοιστρογονική δράση τους και μπορεί να χρησιμοποιηθούν στο μέλλον για ανάλογη μελέτη άλλων ουσιών. Όσον αφορά τις υπό μελέτη απομονωμένες ουσίες και εκχυλίσματα, η εκλεκτική δράση τους στα διάφορα συστήματα (μαστός, μήτρα, οστά) τα καθιστά πιθανούς Εκλεκτικούς Τροποποιητές του Υποδοχέα Οιστρογόνων ή SERM και παρουσιάζει ενδιαφέρον η περαιτέρω in vitro και in vivo μελέτη τους.