Αρσενολιπίδια, φωσφολιπίδια, καροτενοειδή και μέταλλα της Penaeus Kerathurus

Abstract

In the present research work chemical composition (fat, moisture, ash and proteins), lipid composition (of total lipid, polar lipids and neutral lipids including cholesterol and triglycerides) as well as fatty acid composition (of total lipids, polar lipids and of individual classes PE, PC) of the muscle and cephalothorax of shrimp Peneaeus kerathurus were studied. The objective of this work was the determination and the study of molecular structures of phospholipids (PC, PE, Sph and LPC) and arsenolipids as well as the determination of carotenoids which are known for their important biological activity. Moreover, metals and metalloids such as: Fe, Cu, Zn, Mn, Se, Mg, Ni, Cr, Cd, As, Pb and Hg were analysed. In order to achieve the experimental research work as above mentioned, the combination of methodology was applied including HPLC, LC-ESI-MS/MS, NMR, spectroscopy techniques etc. P. kerathurus is the most popular shrimp among the other species of shrimps and represent a substantial part of the Mediterranean diet, is consumed in larger quantities than other edible decapod crustaceans such as prawn, lobster or crab and is subject of aquaculture. The percentage of fat, humidity, ash and protein of the muscle tissue of P. kerathurus was 0.6±0.02% of wet tissue, 77.41±0.27%, 1.93±0.34% and 19.20±0.49% respectively while that of cephalothorax tissue wasl.43±0.04% of wet tissue 39.00±0.18% and 12.02±0.15% respectively (protein was not determined). The polar lipids proportion in muscle and cephalothorax total lipids was found to be 68.02±0.51% and 46.5±0.7% respectively, and they had phospholipids as the major component (>94 % of PL). According to the study of composition of individual classes of muscle and cephalothorax phospholipids was found that PC was the major phospholipids (55.6% and 46.4% respectively) followed by PE (29.3% and 25.7% respectively), while Sph, CL, LPC, PS and PI were determined as minor components. Sterols were the major component of muscle neutral lipids (84,9 % of total neutral lipids) while triacylglycerols were the dominant component of cephalothorax neutral lipids (67.2 % of total neutral lipids). The fatty acids profile of muscle and cephalothorax total lipids did not differ significantly. So, C16:0 (127.24±2.77 and 343.78±12.71 mg/100g of wet tissue), C18:0 (62.99±1.52 and 128.85±8.20 mg/100g of wet tissue), C16:1 ω-9 cis (54.05±0.33 και 103.29±4.06 mg /100g of wet tissue) and C18:1 ω-9 cis (106.97±2.47 and 188.7±17.83 mg/100g of wet tissue) were the main fatty acids. The contents of PUFA, the essential fatty acids were C20:5 ω-3 cis (EPA) σε ποσότητες (166.87±2.57 και 214.49±20.36 mg/100 g of wet tissue respectively) and C22:6 ω-3 cis (DHA) (125.31±1.67 and 208.62±30.27 mg/100g of wet tissue respectively). According to the above-cited results, muscle and cephalothorax lipids contain higher levels of PUFA, mainly ω-3 fatty acids (EPA και DHA) then MUFA. Furthermore, the fatty acid profile of muscle and cephalothorax polar lipids were studied. The contents of SFA were the same, while the content of SFA of individual phospholipid classes (PE, PC) was higher in muscle then cephalothorax. The contents of PUFA of polar lipids and individual phospholipids (PE, PC) were higher in muscle then cephalothorax. The ratio ω-3/ω-6 of polar lipids, PC and PE was higher in muscle (2.49±0.005, 1.66±0.02 και 1.76±0.05) in comparison with that of cephalothorax. The ratio EPA/DHA of PC (3.52±0.002) and PE (2.74±0.01) was higher of unit in muscle as well as cephalothorax. In order to study and identify the molecular structures of phospholipids and arsenolipids, total lipids (of chloroform layer from Bligh-Dyer) of muscle and cephalothorax were separated into neutral and polar lipids by SPE (solid phase extraction) and the ratio between polar lipids and neutral lipids was determined. After that, the qualitative and quantitative analysis of individual lipid classes was performed. Furthermore, molecular species of muscle and cephalothorax phospholipids of shrimp were isolated by preperative TLC in order to analyze and identify: - the molecular structure (diacyl, alkyl-acyl and alkyl-enyl-acyl derivatives) of intact phospholipids in positive ion mode LC- ESI-MS/MS (electrospray ionization tandem Mass Spectrometry ). Precursor ion scanning for m/z 184 selectively detected only [M+H+]ions for choline -containing phospholipids and (the polar choline phosphate head group show a fragment at m/z 184) and fragments at m/z 281, 283 [this signals correspond to [RCOO⁻]ions]. - the molecular structure of individual phospholipids after their hydrolisation (mild alkaline and acid hydrolisation). LC- ESI-MS/MS in the selected reaction monitoring (SRM) mode was used for the detection of organoarsenic species such as: DMA, AC (arsenocoline), oxo- arsenosugars. In order to identify and determine the molecular structure of polar lipids (phospholipids), their main compounds, phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE), as well as Sph and LPC, High Resolution NMR spectroscopy was used. ¹H and 3iP NMR was used for the identification of specific lipid classes. 2D COSY and HSQC techniques as well as 1H spectra ofstandards (PC and PE) were used to elucidate the characteristic peaks ofindividual phospholipids. Two dimensional NMR spectroscopy (COSY, HSQC, HMBC) was applied for the identification of plasmalogens (alk-l-enyl glyceryl ethers) in polar lipids. Distinctive signals corresponding to the protons of double bond (0-CH=CH-) near the vinyl ether group were shown to be the most useful in the qualitative analysis ofplasmalogens . The qualitative and quantitative analysis of carotenoid pigments was performed by high-performance liquid chromatography (HPLC). Carotenoid content of P. kerathurus muscle (3.33±0.07) were lower than in cephalothorax (9.30±0.10 g/100 g of total lipids). The carotenoid profile and content ofPenaeus kerathurus muscle and cephalothorax lipids, is given in Table 10.1.2. The major carotenoid was found canthaxanthin in both muscle (0.73±0.03 mg/100g of wet tissue) and cephalothorax (4.12±0.07 mg/100g of wet tissue), followed by zeaxanthin (0.52±0.03 mg/100g of wet tissue), free astaxannthin (0.42±0.02 mg/100 g of wet tissue) and all-trans lutein (0.32±0.02 mg/100g of wet tissue) in muscle, while free astaxannthin (2.70±0.05 mg/100g of wet tissue), all-trans lutein (2.65±0.05 mg/g of wet tissue) and zeaxanthin (2.29±0.06 mg/100g of wet tissue) were found in cephalothorax (Figure 10.1.1). Furthermore, lesser amount mono ester and diester of astaxanthin were also determined in both tissues, while cryptoxanthin was detected only in cephalothorax. Finally, concentrations of metals and metalloids in samples of muscle and cephalothorax of shrimp were measured (Fe 33,2±0,2 and 98,33±0,1 μg/g dry tissue, Cu 13,08±0,02 and 120,68±0,02 μg/g dry tissue, Zn 110,38±0,09 and 142,15±0,09 pg/g dry tissue, Μn 0,21±0,1 and 1,18±0,1 pg/g dry tissue, Mg 1795±3,1 and 3157±3,1 pg/g dry tissue, Ni 0,03±0,02 and 0,17±0,02 pg/g dry tissue, Cd 0,025±0,01 and 0,46±0,01 μg/g dry tissue, Pb 1,57±0,1 and 1,65±0,1 μg/g dry tissue, and metalloids (Se 0,27±0,4 and 0,068±0,4 μg/g dry tissue, As 35,05±0,2 and 27,4±0,2 μg/g dry tissue), by Atomic Absorbtion Spectrometry. Cr was not detected in both tissues, while Hg was found only in cephalothorax (0,068±3,1μg/g dry tissue). As shrimps consist of protein, phospholipids carotenoids, metals and polyunsaturated fatty acids ω-3, they present high nutritional value and are estimated as a source of arsenolipids and arsenosugars with important biological activity.

Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η γενική χημική σύσταση (λίπος, υγρασία, τέφρα, και πρωτεΐνες), η σύσταση των ολικών, πολικών και ουδετέρων λιπιδίων (χοληστερόλη και τριγλυκερίδια), η σύσταση των λιπαρών οξέων των ολικών, πολικών, καθώς και των επί μέρους τάξεων των κυριοτέρων πολικών λιπιδίων (PC και ΡΕ), στους μύες και κεφαλοθώρακες της γαρίδας Peneaus kerathurus. Η εργασία εστιάσθηκε κυρίως στον προσδιορισμό και τη μελέτη της μοριακής δομής των φωσφολιπιδίων (PC, PE, Sph και LPC) και αρσενολιπιδίων, καθώς και τον προσδιορισμό των καροτενοειδών, τα οποία αποτελούν ενώσεις με σημαντικές βιολογικές δράσεις. Επίσης προσδιορίσθηκαν μέταλλα και μεταλλοειδή όπως Fe, Cu, Zn, Mn, Se, Mg, Ni, Cr, Cd, As, Pb, Hg. Για αυτό το λόγο εφαρμόστηκε συνδυασμένη μεθοδολογία η οποία περιελάμβανε τεχνικές HPLC, LC-ESIMS/MS, NMR, φασματομετρικές κ.α. Για την παραπάνω μελέτη επιλέχθηκαν γαρίδες του είδους Ρ. kerathurus οι οποίες αποτελούν σημαντικό μέρος της μεσογειακής διατροφής και καταναλώνονται σε μεγαλύτερη κλίμακα από τα υπόλοιπα καρκινοειδή (αστακοί, καραβίδες, καβούρια), ενώ αποτελεί και αντικείμενο ιχθυοκαλλιέργειας . Το λίπος, η υγρασία, η τέφρα και οι πρωτεΐνες των μυών της Ρ. kerathurus βρέθηκαν 0.6±0.02% επί του νωπού ιστού, 77.41±0.27%, 1.93±0.34% και 19.20±0.49% αντίστοιχα και των κεφαλοθωράκων 1.43±0.04% επί του νωπού ιστού, 39.00±0.18%, και 12.02±0.15% αντίστοιχα (δεν έγινε προσδιορισμός πρωτεϊνών). Τα πολικά λιπίδια βρέθηκαν ότι αποτελούσαν το 68.02±0.51% των ολικών λιπιδίων των μυών της Ρ. kerathurus ενώ μόνο το 46.5±0.7% των κεφαλοθωράκων. Επίσης βρέθηκε ότι τα πολικά λιπίδια των μυών και των κεφαλοθωράκων αποτελούνται κυρίως από φωσφολιπίδια (> 94% των πολικών λιπιδίων). Η μελέτη της σύστασης των επιμέρους τάξεων των πολικών λιπιδίων των μυών και κεφαλοθωράκων έδειξε ότι η φωσφατιδυλοχολίνη (PC) αποτελεί το κύριο φωσφολιπίδιο (55.6% και 46.4% αντίστοιχα) ενώ ακολουθεί η φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (ΡΕ) (29.3% και 25.7% αντίστοιχα). Η σφιγγομυελίνη (Sph), η καρδιολιπίνη (CL), η λυσο-φωσφατιδυλοχολίνη (LPC), η φωσφατιδυλοσερίνη (PS) και η φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (ΡΙ) προσδιορίσθηκαν σε μικρότερα ποσοστά. Στα ουδέτερα λιπίδια των μυών βρέθηκε ότι οι στερόλες αποτελούσαν το κύριο συστατικό (84.9% των ολικών ουδετέρων λιπιδίων) ενώ στα ουδέτερα λιπίδια των κεφαλοθωράκων, το κύριο συστατικό ήταν τα τριγλυκερίδια (67.2% των ολικών ουδετέρων λιπιδίων). Από την μελέτη της σύστασης των λιπαρών οξέων των ολικών λιπιδίων των μυών και κεφαλοθωράκων βρέθηκε ότι τα κυριότερα κορεσμένα λιπαρά οξέα στους μύες και κεφαλοθώρακες ήταν το C16:0 (παλμιτικό) σε ποσότητες 127.24±2.77 και 343.78±12.71mg/100g νωπού ιστού αντίστοιχα, και το C18:0 (στεατικό) σε ποσότητες 62.99±1.52 και 128.85±8.20 mg/100g νωπού ιστού αντίστοιχα, τα κύρια μονοακόρεστα το C16:1 ω-9 cis (παλμιτελαϊκό) σε ποσότητες 54.05±0.33 και 103.29±4.06 mg /100g νωπού ιστού αντίστοιχα και το C18:1 ω-9 cis (ελαϊκό) σε ποσότητες 106.97±2.47 και 188.7±17.83 mg/100g νωπού ιστού αντίστοιχα. Στα κύρια πολυακόρεστα λιπαρά οξέα βρέθηκε το C20:5 ω-3 cis (EPA) σε ποσότητες 166.87±2.57 και 214.49±20.36 mg/100g νωπού ιστού αντίστοιχα όπως και το C22:6 ω-3 cis (DHA) σε ποσότητες 125.31±1.67 και 208.62±30.27 mg/100g νωπού ιστού αντίστοιχα. Από τα παραπάνω αποτελέσματα φαίνεται ότι οι μύες και οι κεφαλοθώρακες ήταν πλουσιότεροι σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα και ιδιαιτέρως σε ω-3 (EPA και DELA) έναντι των μονοακόρεστων. Όσο αφορά τον προσδιορισμό των περιεχομένων λιπαρών οξέων στα πολικά λιπίδια και σε επιμέρους τάξεις φωσφολιπιδίων, το ποσοστό των κορεσμένων λιπαρών οξέων των πολικών λιπιδίων των μυών και κεφαλοθωράκων της P. kerathurus ήταν παρόμοιο, ενώ το ποσοστό των κορεσμένων λιπαρών οξέων των επιμέρους τάξεων των φωσφολιπιδίων PC και ΡΕ των μυών της γαρίδας ήταν μεγαλύτερο από αυτό των κεφαλοθωράκων. Το ποσοστό των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων των πολικών λιπιδίων των μυών καθώς και των επιμέρους τάξεων των φωσφολιπιδίων PC και ΡΕ βρέθηκε μεγαλύτερο συγκριτικά με αυτό στα αντίστοιχα κλάσματα των κεφαλοθωράκων. Η αναλογία ω-3/ω6 βρέθηκε ότι ήταν μεγαλύτερη στα πολικά λιπίδια, στην φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και την φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (ΡΕ) των μυών (2.49±0.005, 1.66±0.02 και 1.76±0.05) συγκριτικά με την ίδια αναλογία στους κεφαλοθώρακες. Ο λόγος EPA/DHA βρέθηκε μεγαλύτερος της μονάδας στην φωσφατιδυλοχολίνη (3.52±0.002) και φωφατιδυλοαιθανολαμίνη (2.74±0.01) τόσο των μυών όσο και των κεφαλοθωράκων. Για την ταυτοποίηση της μοριακής δομής των φωσφολιπιδίων και αρσενολιπιδίων, στα ολικά λιπίδια (χλωροφορμική φάση από Bligh-Dyer) των μυών και κεφαλοθωράκων της μελετούμενης γαρίδας τα πολικά λιπίδια (φωσφολιπίδια) απομονώθηκαν από τα ολικά λιπίδια των μυών και κεφαλοθωράκων (χωριστά) της γαρίδας P. kerathurus με την τεχνική Εκχύλισης Στερεάς Φάσης (SPE), προσδιορίστηκε η αναλογία πολικών και ουδετέρων, ακολούθησε ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των επιμέρους λιπιδικών τάξεων και στη συνέχεια απομονώθηκαν τα μοριακά είδη φωσφολιπιδίων των μυών και κεφαλοθωράκων της γαρίδας με παρασκευαστική TLC, αναλύθηκαν πρώτα: • Ως αμιγή μοριακά είδη με ηλεκτροψεκασμό θετικών ιόντων σε σειρά με φασματομετρία μαζών (ESI-MS/MS) όπου ταυτοποιήθηκαν αλκυλο-ακυλο-, αλκενυλο-ακυλο- και διακυλο-παράγωγα. Ανιχνεύθηκαν ως κύριο πρόδρομο ιόν το θετικό ψευδο-μοριακό ιόν [Μ+ΗΓ] και ως παραγόμενο ιόν του, το βασικό ιόν της κεφαλής-ομάδας (π.χ φωσφοχολίνη σε τιμή m/z 184) καθώς και κορυφές με τιμές m/z που αντιστοιχούν σε ιόντα λιπαρών οξέων [RCOO⁻]. • Ως υδρολυμένα μόρια (μετά από ήπια αλκαλική και μερική όξινη υδρόλυση), με την εφαρμογή της τεχνικής LC-MS/MS με παρακολούθηση επιλεγμένων αντιδράσεων (SRM) για τον προσδιορισμό ενώσεων του αρσενικού όπως: DMA, AC (αρσενοχολίνη), οξο- και θειο-αρσενοσάκχαρα. Επίσης για την ποιοτική ανάλυση καθώς και για τον προσδιορισμό της μοριακής δομής των πολικών λιπιδίων (φωσφολιπιδίων), των κυριότερων ενώσεων τους, φωσφατιδυλοχολίνης (PC) και φωσφατιδυλοαιθανολαμίνης (ΡΕ), καθώς και της σφιγγομυελίνης (SPH) και λυσοφωσφατιδυλοχολίνης (LPC) εφαρμόσθηκε και φασματοσκοπία NMR. Με την τεχνική αυτή μελετήθηκαν τα φάσματα ¹Η και 3iΡ για την κάθε ένωση χωριστά. Η ταυτοποίηση των κορυφών στα φάσματα πρωτονίου των δειγμάτων (PC και ΡΕ) έγινε σε σύγκριση με τα φάσματα πρωτονίου προτύπων ουσιών της PC, ΡΕ, SPH, LPC, καθώς και τα δισδιάστατα πειράματα gCOSY (ομοπυρηνικό πείραμα συσχέτισης πυρήνων υδρογόνου μέσω δεσμού) και HSQC (ετεροπυρηνικό πείραμα συσχέτισης πυρήνων υδρογόνου με τους πυρήνες των ανθράκων που είναι άμεσα συνδεδεμένοι). Επίσης, με χρήση τεχνικών δισδιάστατης φασματοσκοπίας NMR (COSY, HSQC, HMBC) επιβεβαιώθηκε η παρουσία πλασμαλογόνων (αλκυλο-1-ενυλο ether) στο κλάσμα των πολικών λιπιδίων, ταυτοποιώντας τα χαρακτηριστικά πρωτόνια του διπλού δεσμού (0-CH=CH-). Από τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό των καροτενοειδών βρέθηκε ότι η περιεκτικότητα των ολικών καροτενοειδών στους μύες της Ρ. kerathurus (3.33±0.07 mg/g ολικών λιπιδίων) ήταν μικρότερη από την περιεκτικότητά τους στους κεφαλοθώρακες (9.30±0.10 mg/g ολικών λιπιδίων). Όσο αφορά την σύσταση των καροτενοειδών που προσδιορίστηκαν στο λίπος των μυών και των κεφαλοθωράκων της γαρίδας P. kerathurus (Πίνακας 10.1.2) φαίνεται ότι η κανθαξανθίνη είναι το κύριο συστατικό τόσο στους μύες (0.73±0.03 mg/100g νωπού ιστού) όσο και στους κεφαλοθώρακες (4.12±0.07 mg/100g νωπού ιστού). Ακολουθούν η ζεαξανθίνη (0.52±0.03 mg/100 g νωπού ιστού), η ελεύθερη ασταξανθίνη (0.42±0.02 mg/100g νωπού ιστού) και η all-trans-komeivr\(0.32±0.02 mg/100g νωπού ιστού) στους μύες καθώς και η ελεύθερη ασταξανθίνη (2.70±0.05 mg/100g νωπού ιστού), η all-trans-Xovxeivr\(2.65±0.05 mg/g νωπού ιστού) και η ζεαξανθίνη (2.29±0.06 mg/100g νωπού ιστού) στους κεφαλοθώρακες (Σχήμα 10.1.1). Σε μικρότερες ποσότητες προσδιορίσθηκαν μονοεστέρες και διεστέρες της ασταξανθίνης στους μύες και κεφαλοθώρακες, ενώ η κρυπτοξανθίνη ανιχνεύθηκε μόνο στους κεφαλοθώρακες. Τέλος, σε λυοφυλιωμένα δείγματα των μυών και κεφαλοθωράκων της γαρίδας προσδιορίσθηκαν μέταλλα σε μg/g ξηρού ιστού (Fe 33,2±0,2 και 98,33±0,1 μg/g ξηρού ιστού, Cu 13,08±0,02 και 120,68±0,02 μg/g ξηρού ιστού, Zn 110,38±0,09 και 142,15±0,09 μg/g ξηρού ιστού, Μn 0,21±0,1 και 1,18±0,1 μg/g ξηρού ιστού, Mg 1795±3,1 και 3157±3,1 μg/g ξηρού ιστού, Ni 0,03±0,02 και 0,17±0,02, Cd 0,025±0,01 και 0,46±0,01, Pb 1,57±0,1 και 1,65±0,1 μg/g ξηρού ιστού αντίστοιχα, και μεταλλοειδή (Se 0,27±0,4 και 0,068±0,4 μg/g ξηρού ιστού, As 35,05±0,2 και 27,4±0,2 μg/g ξηρού ιστού), με φασματομετρία ατομικής απορρόφησης. Σε κανέναν από τους δυο ιστούς δεν προσδιορίσθηκε Cr. Hg (0,068±3,1μg/g ξηρού ιστού) προσδιορίσθηκε μόνο στους κεφαλοθώρακες. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν τις γαρίδες ως τρόφιμο με σύσταση ανερχόμενου ενδιαφέροντος, δεδομένης της υψηλής περιεκτικότητάς τους σε φωσφολιπίδια, ξανθοφύλλες και πολυακόρεστα ω-3 λιπαρά οξέα, όπως και ως σημαντική πηγή αρσενολιπιδίων και αρσενοσακχάρων, τα οποία αποτελούν ενώσεις με σημαντικές βιολογικές δράσεις.