Η επίδραση της bevacizumab στην επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου: πειραματική μελέτη σε επίμυες

Abstract

The angiogenesis plays an important role in both wound healing and metastatic invasion and spread of malignant cells by supplying the cells with the required nutrients and oxygen. The VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) has a significant value in the angiogenesis process in normal conditions such as in wound healing, as well as in malignant diseases. The levels of VEGF have been found particularly high in the vast majority of malignant tumors including colorectal cancer; this is in relation with the increased metastatic capability of the tumor and with poorer prognosis. Therefore, inhibition of angiogenesis could limit the extent of the malignant development by restricting the growth and metastasis of tumor cells. Bevacizumab is a recombinant humanized monoclonal antibody (IgG1) that binds VEGF-A, forming a complex molecule, and inhibits binding of VEGF-A with VEGF tyrosine kinase receptors (VEGFRs), resulting in blockage of VEGF-mediated signaling pathways leading to angiogenesis. The antiangiogenetic agent bevacizumab is used with increasing frequency in the management of advanced colorectal cancer and in other malignancies; however, taking in view any concern of negative effect on wound healing, it is not well defined which is the actual time for its use from operation. Despite the recommendations and current clinical practice, there has not been any evidence based optimal time for its safe use. This initiative experimental study in rats was designed to investigate the effect of angiogenesis inhibitor bevacizumab on colon anastomotic healing by assessing some specific factors implicated in wound healing process, highlighting ultimately the degree of healing capability. Forty Wistar rats were used. All animals received premedication with light ether and were anaesthetized with intraperitoneal injection of ketamine at dose 40 mg per Kg BW. Under aseptic conditions the surgeon performed a laparotomy by midline incision (average length of 4-5 cm), controlled the peritoneal cavity, found the colon; then resection a part of it and an end-to-end anastomosis in one layer with interrupted sutures with atraumatic Prolene 6-0. The closure of the abdominal wound was achieved in two layers with continuous Prolene 2-0. It was followed by recovery and monitoring of the animals. The rats were randomly divided into four groups of 10 animals each. The A and B groups were the study groups. In these groups, after the performance of anastomosis and before the closure of the abdomen, a solution of the substance bevacizumab (Avastin, Roche Pharma AG, Grenzach-Wyhlen, Germany) in a single dose of 5 mg/kg of body weight was administered intraperitoneally. The C and D groups were the control groups. In these groups instead of the above mentioned bevacizumab solution, only normal saline in equal amount was administered intraperitoneally. All animals recovered well, gained weight and remained healthy throughout the experiment. No bleeding events were noted in any case. Group A and Group C animals were sacrificed on the 7th postoperative day, whereas those of Group B and Group D were sacrificed on the 14th postoperative day. Upon sacrifice, inspection and recording of wound healing score and reopening of the midline incision was performed, followed by careful inspection of the peritoneal cavity for adhesions or collections particularly in the anastomotic area. Following a resection of a 5 cm segment of the colon including the anastomosis was performed and prepared appropriately for bursting pressure measurement; after ligation of the one end and connection of the other end with mercury manometer dipping into water. After that, one-third of the anastomosis tissue was fixed in 10 % formalin solution and sent for histological examination. The rest of the anastomosis tissue placed in sterile Eppendorf tubes and were stored at -70°C. By paracentesis 3-5 cc of blood from Inferior Vena Cava was taken for assessing the studied parameters. A part of the skin from the abdominal wound was resected for histological examination and tissue hydroxyproline assessment; finally euthanasia follows. Deeply frozen anastomoses tissues were homogenized and processed for the assays according to manufacturer instructions of the relevant kits. The biochemical measurements included VEGF, endothelin- 1 (ET-1), C-reactive protein (CRP), prooxidant - antioxidant balance (PAB), carbonylated proteins and hydroxyproline. Histological sections of anastomoses and skin tissues were prepared from paraffin blocks and staining with haematoxylin - eosin. Light microscopy identified the presence of epithelial cells (epithelialization), fibroblasts, collagen and granular tissue. For statistical analysis the Mann Whitney U test was used (s.s. when p<0.05). Hydroxyproline is useful for routine measurement of collagen content in tissue specimens extracts; the presence of it, on 14th day was higher than on 7th day in both control and study groups as expected, but without statistical significance (s.s.). Likewise, it did not differ s.s. between Avastin and Placebo groups. Bevacizumab did not influence anastomotic tissue hydroxyproline level and subsequently the collagen concentrations. The integrity of anastomosis in all cases, in combination with no s.s. differences in histopathological examination (inflammation, fibroblasts, collagen, fibrosis) score or adhesion score, indicate adequate healing capability in all experimental animals, which were not finally affected by bevacizumab administration. However, the bursting strength is the most relevant clinical parameter. The use of Avastin had no substantial effect on anastomotic strength, since the bursting pressure was lower in Avastin groups compared with Placebo groups both on 7th and 14th postoperative days, without statistical significance. VEGF was found increased in Avastin group with s.s. on 7th day, but inactive, when compared with placebo group on 7th day (p=0.010). Also, in control group without Avastin it was detected higher on 14th day than on 7th day with s.s. (p=0.047), indicating a continuing angiogenetic activity. Parallel and in accordance with VEGF measurements were those of CRP. It was found increased s.s. on 7th day in Avastin group compared with placebo group (p=0.007). Likewise, it was higher with s.s. in control group without Avastin on 14th day than on 7th day (p=0.009). ET-1, which is an ischemic marker, was found higher with s.s. in Avastin group on 14th day than on 7th day (p=0.027). The PAB was found in Avastin group decreased s.s. on 14th day compared with 7th day (p=0.021) indicating a decline in the degree of the oxidative stress. Carbonyl proteins, which are a general biomarker of severe oxidative protein damage, were found increased s.s. in placebo group on 7th day, when compared with both Avastin group on 7th day (p=0.003) and placebo group on 14th day (p=0.009). Likewise, bevacizumab had no influence on abdominal wound healing also, by inspection as well as by neither histopathology nor hydroxyproline levels. In serum the values of CRP were higher s.s. in control group without Avastin on 14th day than on 7th day (p=0.009) and then in Avastin group on 14th day (p=0.002). Also, carbonyl proteins were higher s.s. in Avastin group on 14th day than on 7th day (p=0.023). The rest of the above parameters in serum and those of ET-1 and PAB did not have any s.s. difference. Bevacizumab, when administered intraperitoneally during the operation, had no significant proven effect on colon anastomotic healing in rats. This experimental study has proved, despite the caused transient ischemia and oxidative stress, no significant alterations in collagen synthesis and fibrosis or in bursting pressure, indicating no crucial impairment of wound healing process. Also, it seems that it has no substantial influence on the abdominal wound healing.

Η αγγειογένεση παίζει σημαντικό ρόλο, τόσο στην επούλωση του τραύματος, όσο και την μεταστατική διασπορά των κακοήθων όγκων που αφορά την διήθηση και εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων. Η αναστολή της στοχεύει στον περιορισμό του όγκου και την καλύτερη θεραπευτική προσέγγιση. Στα πλαίσια της στοχευμένης θεραπείας, ο νεότερος αντιαγγειογενετικός παράγοντας bevacizumab χρησιμοποιείται με αυξανόμενη συχνότητα, σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, στην σύγχρονη αντιμετώπιση κυρίως του προχωρημένου ορθοκολικού καρκίνου, αλλά και άλλων κακοηθειών. Λαμβάνοντας όμως υπόψη την ενδεχόμενη αρνητική επίδραση του στην επούλωση του τραύματος, δεν είναι επακριβώς καθορισμένος ο πραγματικός χρόνος της χρήσης του από την εγχείρηση. Παρά τις συστάσεις και την ακολουθούμενη τακτική στην σύγχρονη κλινική πράξη, δεν υπάρχει ιδανικός χρόνος για την ασφαλή της χρήση που να βασίζεται σε αποδείξεις. Η μελέτη αυτή σχεδιάσθηκε για να διερευνήσει την επίδραση της αναστολής της αγγειογένεσης από την bevacizumab, ένα ανθρωποποιημένο μονοκλωνικό αντίσωμα εναντίον του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (anti-VEGF), στην επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου, με τον προσδιορισμό ορισμένων ειδικών παραγόντων που εμπλέκονται. Χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματόζωα 40 άρρενες επίμυες τύπου Wistar, τα οποία έλαβαν προνάρκωση με αιθέρα και αναισθησία με ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση κεταμίνης 40 mg/Kgr Β.Σ. Υπό άσηπτες συνθήκες εκτελούνταν μέση λαπαροτομία μήκους 4-5 cm, ανεύρεση και διατομή του σιγμοειδούς κόλου, καθώς και Τ.Τ. αναστόμωση σε ένα στρώμα με μεμονωμένες ραφές ατραυματικού Prolene 6-0. Ακολουθούσε σύγκλειση του κοιλιακού τραύματος σε δύο στρώματα με συνεχή ραφή Prolene 2-0, ανάνηψη και παρακολούθηση του πειραματόζωου. Οι επίμυες χωρίσθηκαν σε τέσσερις ομάδες των 10 πειραματόζωων έκαστη. Η Α και Β ομάδα αποτελούσαν τις ομάδες μελέτης. Σε αυτές μετά την ολοκλήρωση της αναστόμωσης και πριν την σύγκλειση της κοιλιάς, χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά bevacizumab (σκεύασμα Avastin της εταιρίας Roche) σε δόση 5 mg/Kgr Β.Σ. Η Γ και Δ ομάδα αποτελούσαν τις ομάδες ελέγχου και χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά ισόποση ποσότητα φυσιολογικού ορού (placebo). Όλα τα πειραματόζωα ανένηψαν καλώς, ανέκτησαν βάρος και ολοκλήρωσαν το πείραμα. Τα πειραματόζωα της ομάδας Α και της ομάδας Γ θυσιάσθηκαν την 7η μετεγχειρητική ημέρα και αυτά της ομάδας Β και της ομάδας Δ την 14η μετεγχειρητική ημέρα. Εκτελούνταν επισκόπηση για εκτίμηση της επούλωσης τραύματος και διάνοιξη της προηγηθείσας τομής, επιμελής έλεγχος της περιτοναϊκής κοιλότητας για συμφύσεις, εκτομή του παχέος εντέρου με την αναστόμωση σε μήκος 5 cm και μέτρηση της πίεσης διάσπασης, αφού το ένα άκρο του εντέρου απολινώνονταν, το άλλο συνδέονταν με υδραργυρικό μανόμετρο και τοποθετούνταν μέσα σε νερό. Το ένα τρίτο της αναστόμωσης τέθηκε σε διάλυμα φορμόλης 10% και απεστάλη για ιστολογική εξέταση. Τα υπόλοιπα δύο τρίτα της αναστόμωσης τοποθετήθηκαν σε ειδικά φιαλίδια με φυσιολογικό ορό, διατηρήθηκαν σε βαθιά κατάψυξη (-70°C) και πραγματοποιήθηκε μετά ομογενοποίηση και ειδική επεξεργασία προσδιορισμός στον ιστό συγκεκριμένων παραμέτρων με χρησιμοποίηση αναλόγων KIT. Από την κάτω κοίλη φλέβα με παρακέντηση λήφθηκαν 3-5 cc αίμα και προσδιορίσθηκαν οι υπό μελέτη παράμετροι. Ακολούθως λαμβάνονταν τεμάχιο δέρματος από την τομή για ιστολογική εξέταση και ιστικό προσδιορισμό υδροξυπρολίνης, καθώς και ευθανασία του πειραματόζωου. Οι βιοχημικές μετρήσεις περιλάμβαναν VEGF, ET-1, CRP, ισορροπία οξειδωτικών - αντιοξειδωτικών παραγόντων, καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες και υδροξυπρολίνη. Για την στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το Mann Whitney test (όριο σημαντικότητας p<0,05). Η τιμή της υδροξυπρολίνης, που εκφράζει το περιεχόμενο κολλαγόνο σε ιστούς, στην αναστόμωση την 14η ημέρα ήταν υψηλότερη από αυτή την 7η ημέρα και στις ομάδες ελέγχου και στις ομάδες μελέτης, αλλά χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά. Η bevacizumab δεν επηρέασε τα επίπεδα της υδροξυπρολίνης στον ιστό της αναστόμωσης. Η διαβάθμιση της ιστολογικής εξέτασης (φλεγμονή, ινοβλάστες, κολλαγόνο, ίνωση) ή η διαβάθμιση των συμφύσεων, δεν επηρεάσθηκε από τη χορήγηση της bevacizumab. Η χορήγηση της bevacizumab δεν είχε ουσιαστική επίδραση στην ισχύ της αναστόμωσης, αφού η πίεση διάσπασης ήταν χαμηλότερη στις ομάδες μελέτης (Avastin) σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (placebo) και στις δύο, την 7η ημέρα και την 14η ημέρα, αλλά χωρίς στατιστική σημαντικότητα. Οι τιμές του VEGF στην αναστόμωση βρέθηκαν αυξημένες στατιστικά σημαντικά στην ομάδα μελέτης (Avastin) την 7η ημέρα, αλλά αδρανείς, σε σύγκριση με αυτές στην ομάδα ελέγχου (placebo) την 7η ημέρα. Στην ομάδα ελέγχου χωρίς Avastin οι τιμές του VEGF ήταν υψηλότερες στατιστικά σημαντικά την 14η ημέρα από, ότι την 7η ημέρα. Παράλληλα και σε αντιστοιχία με τα ευρήματα του VEGF βρέθηκαν και οι μεταβολές της CRP στην αναστόμωση. Αυτή βρέθηκε αυξημένη στατιστικά σημαντικά στην ομάδα μελέτης (Avastin) την 7η ημέρα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (placebo) την 7η ημέρα. Παρομοίως, η CRP ήταν υψηλότερη στατιστικά σημαντικά την 14η ημέρα από, ότι την 7η ημέρα στην ομάδα ελέγχου χωρίς Avastin. Η ενδοθηλίνη-1, που είναι δείκτης του βαθμού ισχαιμίας, βρέθηκε στην αναστόμωση στην ομάδα μελέτης (Avastin) υψηλότερη στατιστικά σημαντικά την 14η ημέρα, από ότι την 7η ημέρα. Η ισορροπία οξειδωτικών-αντιοξειδωτικών παραγόντων βρέθηκε στην αναστόμωση στην ομάδα μελέτης (Avastin) ελαττωμένη στατιστικά σημαντικά την 14η ημέρα, από ότι την 7η ημέρα. Οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες, που θεωρούνται βιολογικός δείκτης βαριάς οξειδωτικής πρωτεϊνικής βλάβης, βρέθηκαν στην αναστόμωση αυξημένες στατιστικά σημαντικά στην ομάδα ελέγχου (placebo) την 7η ημέρα σε σύγκριση και με τις δύο, την ομάδα μελέτης (Avastin) την 7η ημέρα και την ομάδα ελέγχου (placebo) την 14η ημέρα. Η bevacizumab δεν επηρέασε, ούτε την επούλωση του κοιλιακού τραύματος, τόσο μακροσκοπικά, όσο και ιστολογικά. Οι τιμές της υδροξυπρολίνης στον ιστό δεν διέφεραν στατιστικά σημαντικά. Στο αίμα οι τιμές της CRP ήταν υψηλότερες στατιστικά σημαντικά στην ομάδα ελέγχου την 14η ημέρα, από ότι την 7η ημέρα, καθώς και, από ότι την 14η ημέρα στην ομάδα Avastin. Επίσης οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες ήταν υψηλότερες στατιστικά σημαντικά στην ομάδα Avastin την 14η ημέρα, από ότι την 7η ημέρα. Οι υπόλοιπες τιμές στο αίμα αυτών των παραμέτρων, καθώς και της ET-1 και της ισορροπίας οξειδωτικών - αντιοξειδωτικών παραγόντων δεν διέφεραν στατιστικά σημαντικά. Συμπερασματικά, η διεγχειρητική ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση της bevacizumab δεν είχε σημαντική αποδεδειγμένη επίδραση στην επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου και του κοιλιακού τραύματος σε επίμυες. Η μελέτη αυτή παρά την προκαλούμενη παροδική ισχαιμία και το οξειδωτικό stress, δεν απέδειξε σημαντικές μεταβολές στην σύνθεση του κολλαγόνου και την ίνωση, ούτε στην πίεση διάσπασης που εκφράζει την ισχύ της αναστόμωσης.