Μελέτη του ρόλου των p73 ισομορφών στον καρκίνο του πνεύμονα

Abstract

The p73 gene possesses an extrinsic P1 promoter and an intrinsic P2 promoter, resulting in synthesis of the full-length TAp73 and the N-terminal-truncated ΔNp73 isoforms, respectively. The ultimate effect of p73 in oncogenesis is thought to depend on the apoptotic TAp73 to the antiapoptotic ΔNp73 isoforms’ ratio. The selective activation of p73 promoters could trigger the expression of either the apoptotic or the antiapoptotic p73 isoforms, thus shifting the ΔN/ΤΑ ratio towards an oncogenic or an oncosuppression direction. Therefore, the epigenetic and transcription factors that differentially activate P1 and P2 promoters are crucial deterninants of the role of p73 in cancer, since they can alter the ΔN/ΤΑ ratio. This study was aimed at identifying novel epigenetic and transcription factors that affect both TAp73 and ΔNp73 isoform synthesis in the context of lung cancer, where both TAp73 and ΔNp73 isoforms have been previously found overexpressed. First, we investigated the DNA methylation status of both promoters as a means of epigenetic transcriptional control of their corresponding isoforms in 102 primary non-small cell lung carcinomas (NSCLCs). We demonstrated that while P1 hypermethylation-associated reduction of TAp73 mRNA levels is rare, the P2 hypomethylation-associated overexpression of ΔNp73 mRNA is a frequent event, particularly among squamous cell carcinomas. P1 promoter remained essentially unmethylated in the majority of lung cancer carcinomas. On the other hand, P2 hypomethylation strongly correlated with the hypomethylation of LINE-1 transposon, a marker of global DNA hypomethylation, indicating that ΔNp73 overexpression may be a passive consequence of global DNA hypomethylation. Since overexpression of TAp73 isoforms could not be attributed to change in the methylation status of P1 promoter, we plausibly hypothesized that it could potentially be caused by deregulated activity of specific transcription factor(s) . In the light of this notion, we then searched for novel transcription factors that could activate P1 promoter and result to TAp73 overexpression in lung cancer. With the use of bioinformatics tools, in vitro binding assays, and chromatin immunoprecipitation analysis, a region extending -233 to -204 bps upstream of the transcription start site of the human p73 P1 promoter, containing conserved Sp1 binding sites, was characterized. Treatment of cells with Sp1 RNAi and Sp1 inhibitor functionally suppresses TAp73 expression, indicating positive regulation of P1 by the Sp1 protein. Notably Sp1 inhibition or silencing also reduces ΔΝp73 protein levels. Therefore, Sp1 directly regulates TAp73 transcription and affects ΔΝp73 levels in lung cancer. TAp73γ was shown to be the only TA isoform overexpressed in several lung cancer cell lines and in 26 non-small cell lung cancers, consistent with Sp1 overexpression, thereby questioning the apoptotic role of this specific p73 isoform in lung cancer.

Το γονίδιο p73 διαθέτει έναν εξωτερικό υποκινητή (P1) και έναν εσωτερικό υποκινητή (P2), από τους οποίους συντίθενται οι ισομορφές TAp73 πλήρους μήκους και οι ισομορφές ΔNp73 με περικομμένο αμινοτελικό άκρο, αντίστοιχα. Το τελικό αποτέλεσμα του γονιδίου p73 πιστεύεται ότι εξαρτάται από την αναλογία των αποπτωτικών ισομορφών TAp73 προς τις αντιαποπτωτικές ισομορφές ΔNp73. Η επιλεκτική ενεργοποίηση των υποκινητών του γονιδίου p73 θα μπορούσε να επάγει την έκφραση είτε των αποπτωτικών είτε των αντιαποπτωτικών ισομορφών του p73, μετατοπίζοντας με αυτό τον τρόπο την αναλογία ΔN/ΤΑ προς μια ογκογόνο ή ογκοκατασταλτική κατεύθυνση. Κατά συνέπεια, οι επιγενετικοί και οι μεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι ενεργοποιούν με διαφορικό τρόπο τους υποκινητές P1 και P2 αποτελούν σημαντικούς καθοριστικούς συντελεστές του ρόλου του γονιδίου p73, αφού μπορούν να μεταβάλλουν την αναλογία ΔN/ΤΑ. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η ταυτοποίηση νέων επιγενετικών και μεταγραφικών παραγόντων οι οποίοι επηρεάζουν τη σύνθεση των ισομορφών TAp73 και ΔNp73 στον καρκίνο του πνεύμονα, στον οποίο έχουν βρεθεί υπερεκφρασμένες και οι δύο τάξεις ισομορφών. Αρχικά, διερευνήθηκε η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA και των δύο υποκινητών, προκειμένου να καθοριστεί η επιγενετική ρύθμιση της μεταγραφής των αντίστοιχων ισομορφών τους σε 102 πρωτοπαθείς όγκους ασθενών με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Καταδείχτηκε ότι η μείωση των επιπέδων mRNA του TAp73 η οποία οφείλεται σε υπερμεθυλίωση του υποκινητή P1 είναι σπάνια, ενώ αντίθετα η υπερέκφραση του mRNA του ΔNp73 η οποία οφείλεται σε υπομεθυλίωση του υποκινητή Ρ2 είναι ένα συχνό συμβάν, ιδιαίτερα μεταξύ ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα εκ πλακωδών κυττάρων. Ο υποκινητής P1 παρέμεινε ουσιαστικά μη μεθυλιωμένος στην πλειονότητα των καρκινωμάτων του πνεύμονα. Από την άλλη πλευρά, η υπομεθυλίωση του υποκινητή P2 συσχετίσθηκε έντονα με την υπομεθυλίωση του μεταθετονίου LINE-1, το οποίο αποτελεί δείκτη συνολικής υπομεθυλίωσης του DNA. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η υπερέκφραση του ΔNp73 ενδέχεται να αποτελεί παθητική συνέπεια της συνολικής υπομεθυλίωσης του DNA. Καθώς η υπερέκφραση των ισομορφών TAp73 δεν ήταν δυνατό να αποδοθεί σε μεταβολή της κατάστασης μεθυλίωσης του υποκινητή P1, διατυπώθηκε η εύλογη υπόθεση ότι θα μπορούσε πιθανόν να οφείλεται σε απορρυθμισμένη ενεργότητα ειδικού ή ειδικών μεταγραφικών παραγόντων. ...............................