Έκφραση πρωτεϊνών θερμικής καταπληξίας και πρωτεϊνικών κινασών στην παθολογική καρδιά

Abstract

Introduction: Thyroid hormones have various effects on the myocardium that could potentially render the heart less tolerant to ischaemic stress. Surprisingly, hearts from hyperthyroid rats display a different response, when they are subjected to ischaemia as compared to hearts from normal rats, showing accelerated and potentiated ischaemic contracture and enhanced tolerance to ischaemia. It is possible that thyroid hormone per se through its linkage with the nuclear thyroid receptors or the occurring functional and metabolic changes in the hyperthyroid heart to induce changes in gene expression of various molecules that can confer cardioprotection against ischaemic insult. The aim of this study was to investigate the underlying molecular mechanisms of the adaptive response of the hyperthyroid heart to ischaemia. Particularly, it was examined the basal expression of PKCô and ε isoforms and HSP70. the induction of mRNA HSP70 and the p38 MAPK activation after subjection to zero-flow global ischaemia-reperfusion and the pattern of activation of p38 MAPK and JNKs during ischaemia and reperfusion.Methods: Hyperthyroidism was induced in Wistar male rats by thyroxine administration (230pg/kg) for 14 days. In a first group of experiments hearts from untreated normal and hyperthyroid rats (N and T) were examined for the measurement of the basal expression of PKCô and ε isoforms and HSP70 with the Western blotting-immunodetection method. In a second group of experiments thyroxine was administered in Wistar male rats for 14 days (Ti4d) and for 2 days (T2d)i while rats treated similarly with normal saline served as controls (Ni4cj and Noa). Abdominal aortic banding was performed in another group of rats to produce constriction-induced hypertrophy (Hyp), while sham-operated rats served as controls (SOP). Thyroid hormone levels in plasma (T3 and T4) were measured by RIA. Hearts from the above groups were subjected to 20 min zero-flow global ischaemia followed by 43 min of reperfusion. The isolated heart Langendorff preparation was used to study cardiac function and response to ischaemia. Baseline cardiac function was assessed by the left ventricular developed pressure (LVDP) and post- ischaemic functional recovery was assessed by the LVDP at the end of the reperfusion period (LVDP45), expressed as % of the initial value LVDPO (LVDP%). The development of cardiac hypertrophy was assessed by the ratio of left ventricular weight to body weight (LVW/BW). The induction ol mRNA HSP70 and the activation of p38 MAPK after ischaemia-reperfusion were measured by The Northern blotting-hybridization and the Western blotting-immunodetection methods respectively. In a third group of experiments due to the examination of the activation pattern of p38 and JNKs MAPKs during ischaemia and reperfusion, thyroxine was administered in Wistar male rats for 14 days, while rats treated similarly with normal saline served as controls. Isolated hearts from normal and hyperthyroid rats were perfused in Langendorff mode and subjected to: a) 20 min of stabilization period only (Nb and Tb), b) 20 min of stabilization period followed by 10 or 20 min of zero-flow global ischaemia (N10I. T10I, N201 and T20I) and c) 20 min of stabilization period. 20 min of ischaemia followed by 10. 20 or 45 min of reperfusion (N20I/10R. T20I/10R, N201/20R, T20I/20R. N20I/45R and T20I/45R). The activation pattern of p38 and JNKs MAPKs was measured by the Western blotting-immunodetection method.Results: The basal expression of PKCÔ and ε isoforms and HSP70 was changed after administration of thyroxine in rats for 14 days. The expression of PKC8 was 1.7 fold more in hyperthyroid than in normal hearts (p<0.01). In contrast, the expression of PKCe was 1.6 fold more in normal than in hyperthyroid hearts (pcO.Ol). The expression of HSP70 was found 2.1 fold more in hyperthyroid than in normal hearts (p<0.05). Thyroid hormone levels were elevated in T2d and T14d rats as compared to normal rats. Tua rats developed cardiac hypertrophy (LVW/BW=3.1, vs 2.5 in N|4c|. p<0.05), while T2d rats didn’t develop cardiac hypertrophy. Hyp rats also developed cardiac hypertrophy (LVW/BW=2.8, vs 2.5 in SOP. p<0.05). Contractility was increased in Ti4cj hearts (LVDP0= 127.6 mmHg, vs 110.7 mmHg in N]4d, p<0.05), but it was not different between T2d and Nid hearts. Contractility was also increased in Hyp hearts (LVDP0= 132.6 mmHg, vs 97.6 mmHg in SOP, p<0.05). Post-ischaemic functional recovery was enhanced in T]4d hearts (LVDP%=54.9, vs 37.2 in N)4d, p<0.05), while it was not different neither between T2d and N2d nor between Hyp and SOP hearts. Basal expression of niRNA HSP70 was not detected in hearts from any of the experimental groups. The expression of mRNA HSP70 after ischaemia-reperfusion was 2.3 fold greater in T]4d than in Ni4d hearts (p<0.05) and 1.8 fold greater in Hyp than in SOP hearts (p<0.05). There was no statistically significant difference between the T2d and N2d hearts in the induction of mRNA HSP70. Phosphorylated p38 MAPK expression was 2.2 fold more in N]4d than in T]4d hearts (p<0.05), but it was not different between T2d and N2d hearts and between Hyp and SOP hearts. The results of the examination of the activation pattern of p38 and JNKs MAPKs were as follows: activation of p38 MAPK was significantly attenuated during ischaemia and reperfusion in hyperthyroid hearts compared to normal hearts. JNKs were found to be activated only during the reperfusion period. The levels of phospho p54 and p46 JNKs were found to be lower in thyroxine treated hearts as compared to normal hearts, but this reduction was statistically significant only at 10 min of reperfusion. Conclusions: Long-term thyroxine administration in Wistar adults males results in a cardioprotective phenotype which features are: 1) the change in the basal expression of PKC isoforms (increase in PKCÔ and reduction in PKCe isoform), 2) the increased basal expression of HSP70 protein. 3) the increased expression of mRNA HSP70 after ischaemia-reperfusion and 4) the attenuated activation of p38 MAPK during ischaemia and ischaemia-reperfusion.

Εισαγωγή: Οι θυρεοειδ ικές ορμόνες ασκούν πολλαπλές επιδράσεις στο μυοκάρδιο που δυνητικά θα μπορούσαν να το καταστήσουν λιγότερο ανθεκτικό στο ισχαιμικό στρες σε σχέση με το φυσιολογικό μυοκάρδιο. Εντούτοις καρδιές από υπερθυρεοειδικούς επίμυες παρουσιάζουν διαφορετική απάντηση, όταν υποβάλλονται σε ισχαιμία σε σχέση με τις καρδιές φυσιολογικών επιμύων, εμφανίζοντας εντονότερη και γρηγορότερη ισχαιμική σύσπαση και αυξημένη αντοχή στην ισχαιμία. Είναι πιθανόν είτε η θυρεοειδική ορμόνη per se μέσω πρόσδεσής της στους πυρηνικούς θυρεοειδικούς υποδοχείς είτε οι παρατηρούμενες λειτουργικές και μεταβολικές μεταβολές κατά τον υπερθυρεοειδισμό να επάγουν αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μορίων που μπορούν να δράσουν προστατευτικά κατά την ισχαιμία. Αντικείμενο της παρούσας μελέτης αποτελεί η διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών της προσαρμοστικής απάντησης της υπερθυρεοειδικής καρδιάς στην ισχαιμία. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η βασική έκφραση των πρωτεϊνών PKCô και ε και HSP70, η επαγωγή του mRNA HSP70 και η ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ μετά από εφαρμογή ολικής ισχαιμίας μηδενικής ροής-επαναιμάτωσης και η κινητική της ενεργοποίησης των ρ38 ΜΑΡΚ και JNKs κατά τη διάρκεια ισχαιμίας και ισχαιμίας- επαναιμάτωσης.Μέθοδοι: Υπερθυρεοειδισμός προκλήθηκε σε άρρενες επίμυες Wistar με χορήγηση θυροξίνης (250pg/kg) για 14 ημέρες. Σε μια πρδιτη ομάδα πειραμάτων καρδιές από φυσιολογικούς και υπερθυρεοειδικούς επίμυες που δεν υποβλήθηκαν σε κανένα πειραματικό πρωτόκολλο (Φ και Θ) μελετήθηκαν για την ανίχνευση της βασικής έκφρασης των πρωτεϊνών PKCÔ και ε και HSP70 με τη μέθοδο του Western blotting και ανοσοανίχνευσης. Μια δεύτερη ομάδα πειραμάτων περιελάμβανε τη χορήγηση θυροξίνης (250pg/kg) σε επίμυες για 14 ημέρες (Θι4ημ) και για 2 ημέρες (Θτημ), ενώ επίμυες στους οποίους χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός για τα αντίστοιχα χρονικά διαστήματα (Φΐ4ημ και Φ2ημ) χρησιμοποιήθηκαν για μάρτυρες. Υπερτροφία από περίδεση αορτής προκλήθηκε σε επίμυες (Υπέρ) και εικονικώς χειρουργημένοι επίμυες (EX) χρησιμοποιήθηκαν για μάρτυρες. Οι θυρεοειδικές ορμόνες (Τλ και Τ4) μετρήθηκαν στο πλάσμα με RIA. Καρδιές από τις ανωτέρο) ομάδες υποβλήθηκαν σε πρωτόκολλο 20 min ολικής ισχαιμίας μηδενικής ροής-45 min επαναιμάτωσης. Για την εκτίμηση της καρδιακής λειτουργίας και της απάντησης στην ισχαιμία χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος μελέτης απομονωμένης καρδιάς κατά Langendorff. Η καρδιακή λειτουργία εκτιμήθηκε από την αναπτυσσόμενη πίεση της αριστερής κοιλίας (LVDP) και η λειτουργική ανάκαμψη μετά από την ισχαιμία εκτιμήθηκε από την LVDP στο τέλος της επαναιμάτωσης (LVDP45) εκφρασμένη ως % της αρχικής τιμής LVDP0 (LVDP%). Η ανάπτυξη καρδιακής υπερτροφίας εκτιμήθηκε με το δείκτη βάρος αριστερής κοιλίας/βάρος ζώου (ΒΑΚ/ΒΖ). Η μελέτη της έκφρασης του mRNA HSP70 και της ενεργοποίησης της ρ38 ΜΑΡΚ μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση έγινε με τις μεθόδους Northern blotting-υβριδισμού και Western blotting-ανοσοανίχνευσης αντίστοιχα. Σε μια τρίτη ομάδα πειραμάτων με σκοπό τη μελέτη της ενεργοποίησης των ρ38 και JNKs MAPKs κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας και της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης χορηγήθηκε θυροξίνη για 14 ημέρες σε άρρενες επίμυες Wisrar, ενώ επίμυες στους οποίους χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός για το ίδιο χρονικό διάστημα χρησιμοποιήθηκαν για μάρτυρες. Απομονωμένες καρδιές από φυσιολογικούς και υπερθυρεοειδικούς επίμυες αναρτήθηκαν στη συσκευή Langendorff και υποβλήθηκαν α) σε σταθεροποίηση 20 min μόνο (Φσταθ και Θσταθ), β) σε σταθεροποίηση 20 min και σε 10 ή 20 min ισχαιμίας (Φ101, Θ101, Φ20Ι και Θ20Ι) και γ) σε σταθεροποίηση 20 min και σε 20 min ισχαιμίας ακολουθούμενα από 10, 20. ή 43 min επαναιμάτωσης (Φ20Ι/10Ε, Θ20Ι/10Ε, Φ20Ι/20Ε, Θ20Ι/20Ε, Φ20Ι/45Ε και Θ20Ι/45Ε). Η μελέτη της ενεργοποίησης των ρ38 και JNKs MAPKs στις παραπάνιο πειραματικές ομάδες έγινε με τη μέθοδο του Western blotting-ανοσοανίχνευσης. Αποτελέσματα: Η βασική έκφραση των ΡΚΟδ και ε και της HSP70 μεταβλήθηκε μετά από χορήγηση θυροξίνης στους επίμυες για 14 ημέρες. Η έκφραση της ΡΚΟδ ήταν 1.7 φορές μεγαλύτερη στις καρδιές από υπερθυρεοειδικούς επίμυες από ότι στις καρδιές από φυσιολογικούς επίμυες (ρ<0.01 ). Αντίθετα, η έκφραση της ΡΚΟε ήταν 1.6 φορές μεγαλύτερη στις φυσιολογικές από ότι στις υπερθυρεοειδικές καρδιές (ρ<0.01). Η έκφραση της HSP70 βρέθηκε 2.1 φορές μεγαλύτερη στις υπερθυρεοειδικές σε σχέση με τις φυσιολογικές καρδιές (ρ<0.05). Οι θυρεοειδικές ορμόνες βρέθηκαν αυξημένες στο αίμα ζώων μετά από χορήγηση θυροξίνης για 2 και για 14 ημέρες (Θ2ημ και ©ΐ4ημ) σε σχέση με φυσιολογικά ζώα. Οι καρδιές από υπερθυρεοειδικούς επίμυες 14 ημερών (Θ]4ημ) παρουσίασαν καρδιακή υπερτροφία (ΒΑΚ/ΒΖ=3.1 έναντι 2.5 στους Φι4ημ, ρ<0.05), ενώ η χορήγηση θυροξίνης για 2 ημέρες δεν οδήγησε σε ανάπτυξη καρδιακής υπερτροφίας. Καρδιακή υπερτροφία αναπτύχθηκε, επίσης, σε επίμυες μετά από περίδεση αορτής (Υπέρ), (ΒΑΚ/ΒΖ=2.8 έναντι 2.5 στους EX. ρ<0.05). Στις Θι4ημ καρδιές παρατηρήθηκε αυξημένη συσταλτικότητα (LVDP0=127.6 mmHg έναντι 1 10.7 mmHg στις Φΐ4ημ, ρ<0.05), ενά) δεν παρατηρήθηκε το ίδιο στους Θ2ημ επίμυες σε σχέση με τους Φ2ημ. Επίσης, αυξημένη συσταλτικότητα παρατηρήθηκε στις υπερτροφικές καρδιές επιμύων (Υπέρ) μετά από περίδεση αορτής (LVDP0= 132.6 mmHg έναντι 97.6 mmHg στις EX. ρ<0.05). Οι Θ|4ημ καρδιές παρουσίασαν αυξημένη μεθισχαιμική ανάκαμψη (LVDP%=54.9 έναντι 37.2 των Φι4ημ. ρ<0.05), ενώ δεν παρατηρήθηκε διαφορά στο LVDP% ούτε μεταξύ Θ2ημ και Φ2ημ επιμύων ούτε μεταξύ Υπέρ και EX επιμύων. Βασική έκφραση του mRNA HSP70 δεν ανιχνεύτηκε σε καμία από τις πειραματικές ομάδες. Η έκφραση του mRNA HSP70 μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση ήταν 2.3 φορές μεγαλύτερη στις Θ|4ιιμ καρδιές σε σύγκριση με τις Φι4ημ (ρ<0.05) και 1.8 φορές μεγαλύτερη στις Υπέρ καρδιές σε σχέση με τις EX καρδιές (ρ<0.05). Δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στην έκφραση του mRNA HSP70 στις 02ημ καρδιές σε σχέση με τις Φ2ημ. Η ρ38 ΜΑΡΚ βρέθηκε να ενεργοποιείται μετά από ισχαιμία-επαναιμάτωση 2.2 φορές περισσότερο στις Φ|4ημ καρδιές σε σχέση με τις Θι4ημ (ρ<0.05), ενώ δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ μεταξύ καρδιών 02 ημ και Φ2ημκαι μεταξύ Υπέρ και EX καρδιών. Τα αποτελέσματα της κινητικής της ενεργοποίησης των ρ38 και JNKs MAPKs έχουν ως εξής: η φωσφορυλιωμένη ρ38 ΜΑΡΚ βρέθηκε μειωμένη στις υπερθυρεοειδικές καρδιές σε σχέση με τις φυσιολογικές τόσο κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας όσο και κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης. Οι JNKs βρέθηκαν να ενεργοποιούνται μόνο κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης. Τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων ρ46 και ρ54 JNKs βρέθηκαν μειωμένα στις υπερθυρεοειδικές σε σχέση με τις φυσιολογικές καρδιές κατά τη διάρκεια της επαναιμάτωσης, η μείωση, όμως, αυτή ήταν στατιστικούς σημαντική μόνο στα 10 min της επαναιμάτωσης.Συμπεράσματα: Η μακροχρόνια χορήγηση θυροξίνης σε ενήλικες επίμυες οδηγεί σε έναν καρδιοπροστατευτικό φαινότυπο χαρακτηριστικά του οποίου είναι: 1 ) η μεταβολή στη βασική έκφραση των ισομορφών των PKCs (αύξηση της δ και μείωση της ε ισομορφής), 2) η αυξημένη βασική έκφραση της HSP70, 3) η αυξημένη παραγωγή mRNA HSP70 στο τέλος της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης και 4) η μειωμένη ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ κατά τη διάρκεια της ισχαιμίας και της ισχαιμίας-επαναιμάτωσης.