Μελέτη του μηχανισμού του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από μεθυλιωτικούς παράγοντες

Abstract

The elucidation of the molecular mechanism implicated in cell death following DNA damage induced by anticancer genotoxic agents is crucial for the improvement of chemotherapy effectiveness. Methylating agents constitute a widely used class of anticancer drugs. They target DNA inducing DNA methylation adducts, the most biologically significant being O6-methylguanine (O6-meG) that is repaired by the specific repair enzyme O6-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT). Furthermore, there is growing evidence that the molecular mechanism of methylating agent-induced apoptosis and cell death, not fully elucidated yet, is cell type dependent. RNA binding proteins constitute an abundant superfamily of multifunctional proteins. Certain members of this family (specifically hnRNPs) exhibit alterations of their expression during carcinogenesis, a fact related for them being considered as tumour markers. The aim of the present study was to investigate the effect of SΝ1 methylating agents on the cell cycle and on the induced cell death and to examine possible alterations occurring on RNA binding proteins during methylating agent-induced cell death in order to assess their possible use as markers of tumour resistance/sensitivity to chemotherapy. Human cell lines of different origin with varying expression levels of the DNA repair enzyme MGMT, were treated with isotoxic concentrations of N-methyl-N-nitrosourea (MNU), a model SN1 methylating agent. The mechanism of MNU-induced cell death was investigated along with possible modifications of hnRNP proteins. In an MGMT-inducible HeLa Tet-On clonal cell line (cervical carcinoma), cell cycle analysis revealed G2/M arrest followed by induction of apoptosis and dose dependent cell cycle alterations only in cells lacking functional MGMT. Molecular analysis revealed caspase-7 activation and PARP cleavage at late time points. Activation of the mitochondrial pathway in this system was supported by bcl-2 decline and caspase-9 cleavage. Alterations of hnRNP proteins (e.g. C1/C2) were observed upon induction of apoptosis. In A549 (non-small cell lung adenocarcinoma, p53wt) cells, MNU induced G2/M arrest, accompanied by cdc25A degradation, hnRNP B1 induction, hnRNP C1/C2 downregulation. The above findings along with those of the confocal microscopy, which revealed formation of multinucleated cells upon MNU treatment, imply mitotic catastrophe as the mode of cell death. Non-apoptotic cell death was confirmed by the lack of increase in the sub-G1 DNA content, PARP cleavage and caspase-3, -7 activation. In contrast, in H157 (non-small cell lung squamous carcinoma p53null) cells, MNU induced apoptotic cell death, confirmed by confocal microscopy (presence of apoptotic nuclei) cytofluorometry of DNA content and immunodetection of apoptotic markers, accompanied by overexpression of hnRNP B1 and C1/C2. Thus, the mechanism of the cell death induced by SN1 methylating agents is cell type-dependent and must be assessed prior cancer treatment.

Η αποσαφήνιση του μοριακού μηχανισμού του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από τους αντικαρκινικούς, γονοτοξικούς παράγοντες και τις βλάβες που προκαλούν στο DNA, είναι καθοριστικής σημασίας για την βελτίωση της αποτελεσματικότητας της χημειοθεραπείας. Οι μεθυλιωτικοί παράγοντες, αποτελούν μια ευρέως χρησιμοποιούμενη κατηγορία αντικαρκινικών φαρμάκων. Προκαλούν μεθυλιωτικές βλάβες στο DNA, με πιο σημαντική από βιολογική άποψη την O6 μεθυλογουανίνη (O6-meG), η οποία επιδιορθώνεται από το ειδικό επιδιορθωτικό ένζυμο DNA-μεθυλοτρανσφεράση της O6 μεθυλογουανίνης (MGMT). Επιπλέον, συνεχώς αυξανόμενα δεδομένα υποστηρίζουν ότι ο μοριακός μηχανισμός του επαγόμενου κυτταρικού θανάτου από τα μεθυλιωτικά- ο οποίος ακόμα δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί - εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Οι πρωτεΐνες με ικανότητα πρόσδεσης RNA, αποτελούν μια υπεροικογένεια πολυλειτουργικών πρωτεϊνών. Ειδικότερα, οι ετερογενείς πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτεΐνες (hnRNPs) -μέλη αυτής της υπεροικογένειας- εμφανίζουν αλλαγές στην έκφρασή τους κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης. Το γεγονός αυτό τις κατατάσσει στους πιθανούς καρκινικούς δείκτες. Στόχος της παρούσας διατριβής, ήταν η μελέτη της επίδρασης των μεθυλιωτικών παραγόντων SN1 τύπου στον κυτταρικό κύκλο και στον μηχανισμό κυτταρικού θανάτου σε διάφορους κυτταρικούς τύπους και η μελέτη των αλλαγών των πρωτεϊνών της μετα-μεταγραφικής μηχανής με ικανότητα πρόσδεσης RNA, κατά την διάρκεια του επαγόμενου από μεθυλιωτικούς παράγοντες κυτταρικού θανάτου με στόχο την διερεύνηση της δυνητικής χρήσης τους ως δείκτες χημειοευαισθησίας. Χορηγήθηκαν ισοτοξικές δόσεις του πρότυπου μεθυλιωτικού παράγοντα SN1 τύπου, MNU (N-μέθυλο-Ν-νιτροδουρία) σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές διαφορετικής προέλευσης οι οποίες εμφανίζουν ποικίλα επίπεδα έκφρασης του ενζύμου MGMT. Διερευνήθηκε ο μηχανισμός του επαγόμενου κυτταρικού θανάτου, μαζί με πιθανές αλλαγές σε hnRNP πρωτεΐνες. Στην κλωνική κυτταρική σειρά HeLa Tet-On (καρκίνωμα τραχήλου) στην οποία η έκφραση της MGMT μπορεί να επαχθεί, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε G2/M στάση, ακολουθούμενη από επαγωγή απόπτωσης και δοσοεξαρτώμενες αλλαγές στον κυτταρικό κύκλο, μόνο σε κύτταρα χωρίς λειτουργική MGMT. H ανάλυση σε μοριακό επίπεδο, έδειξε πρωτεολυτική ενεργοποίηση της κασπάσης-7 και πρωτεολυτική πέψη της PARP σε προχωρημένα χρονικά σημεία. Η υπόθεση ενεργοποίησης του μιτοχονδριακού μονοπατιού σε αυτό το κυτταρικό σύστημα, ενισχύθηκε από την μείωση των επιπέδων της Bcl-2 αλλά και την πέψη της κασπάσης-9. Επιπλέον, ανιχνεύθηκαν αλλαγές σε hnRNP πρωτεΐνες (πχ hnRNP C1/C2) κατά την επαγωγή απόπτωσης. Στα Α549 (μη μικροκυτταρικό αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, p53wt), η MNU προκάλεσε G2/M στάση, η οποία συνοδεύτηκε από αποδόμηση της cdc25A, επαγωγή της hnRNP B1 και μείωση των επιπέδων της hnRNP C1/C2...