Ανάπτυξη μεθοδολογίας πολυπλεκτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης για την πρώιμη ανίχνευση γενετικού υλικού Ασπεργίλλων σε κλινικά δείγματα

Abstract

Aspergillus pathogens usually infect immunocompromised patients with lethal outcome. Conventional histological, microbiological and radiological methods used in the IA diagnosis are time-consuming and lack sensitivity and specificity. A multiplex PCR assay for the discrimination of the most frequent Aspergillus pathogens, A. fumigatus, A. flavus, A. terreus and A. niger is described herein. In total, 59 Aspergillus isolates were tested in this study. Four species specific primer pairs were designed to amplify the A. terreus rDNA gene and the A. fumigatus, A. awamori, A. niger var. saitoi and A. oryzae aspergillopepsins. The aforementioned primer sets were also tested for possible cross reactions with other clinically significant fungal, bacterial and viral taxa. Except from the A. tamarii isolate, all the tested strains of A. fumigatus, A. flavus, A. niger and A. terreus were successfully amplified producing amplicons of 250bp, 200bp, 150bp and 450bp respectively. The homology of the generated PCR products sequences with the published ones (GenBank) ranged from 95% to 100%. The primer pairs specificity results indicated that the A. terreus ITS regions and the aspergillopepsins exons of A. fumigatus, A. niger, A. flavus were suitable targets for multiplex amplification, aiming at the concurrent rapid differentiation of A. fumigatus, A. flavus, A. niger and A. terreus.

Λοιμώξεις από παθογόνα είδη Ασπεργίλλου συχνά αποβαίνουν μοιραίες για τη ζωή σοβαρά ανοσοκατασταλμένων ασθενών. Η διάγνωση των ασπεργιλλώσεων παραμένει δύσκολη, δεδομένου ότι οι συμβατικές μικροβιολογικές και οι απεικονιστικές μέθοδοι αποτελούν χρονοβόρες διαδικασίες και στερούνται ευαισθησίας και ειδικότητας. Σ’ αυτή τη μελέτη συνολικά εξετάστηκαν 59 στελέχη Ασπεργίλλου με σκοπό την ανάπτυξη μιας πολυπλεκτικής PCR για τη διάκριση των τεσσάρων κλινικώς σημαντικότερων ειδών Ασπεργίλλου A. fumigatus, A. flavus, A. terreus and A. niger. Τα τέσσερα ζεύγη εναρκτών, που χρησιμοποιήθηκαν στην πολυπλεκτική PCR, σχεδιάστηκαν για την ενίσχυση των ITS περιοχών του rDNA του A. terreus και συγκεκριμένων εξωνίων των γονιδίων των ασπεργιλλοπεψινών των ειδών A. fumigatus, A. awamori, A. niger var. saitoi και A. oryzae. Τα ειδικά για τους A. fumigatus, A. flavus, A. niger, and A. terreus ζεύγη εναρκτών ελέγχθηκαν ως προς την ειδικότητά τους σε μεγάλο εύρος κλινικά σημαντικών βακτηρίων, ιών, νηματοειδών μυκήτων και ζυμομυκήτων. Τα προϊόντα ενίσχυσης των ειδών A. fumigatus, A. flavus, A. terreus and A. niger αναλύθηκαν ως προς την νουκλεοτιδική τους αλληλουχία και ελέγχθηκαν ως προς την ομολογία τους με αντίστοιχες κατατεθειμένες στην Τράπεζα γονιδιακών δεδομένων (GenBank). Εκτός του στελέχους A. tamarii, όλα τα εξετασθέντα στελέχη A. fumigatus, A. flavus, A. niger, and A. terreus, έδωσαν προϊόντα ενίσχυσης με διακριτό μεταξύ τους μέγεθος 250bp, 200bp, 150bp και 450bp αντίστοιχα. Η ομολογία της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των προϊόντων ενίσχυσης με τις αντίστοιχες κατατεθειμένες στην Τράπεζα NCBI ήταν ιδιαιτέρως υψηλή (95- 100%). Η ειδικότητα των χρησιμοποιηθέντων εναρκτών έδειξε ότι τα εξώνια των ασπεργιλλοπεψινών των ειδών A. fumigatus, A. flavus και A. niger και οι περιοχές ITS του A. terreus αποτελούν κατάλληλους στόχους για ενίσχυση και συνεπώς για την ανάπτυξη μιας πολυπλεκτικής PCR με απώτερο στόχο τη διάκριση των προαναφερθέντων τεσσάρων κλινικώς σημαντικότερων ειδών Ασπεργίλλου σε κλινικά δείγματα.