Ανάπτυξη και αξιολόγηση αντισωμάτων για τη μελέτη μικρομοριακών ενώσεων με βιοχημικό ενδιαφέρον

Abstract

In the present work, polyclonal antibodies for biotin, a low molecular weight substance (hapten) of biochemical and biotechnological interest were developed and evaluated. Anti-biotin antibodies are generally considered important bioanalytical tools, since they can be used in research on biotin and endogenous biotinylated proteins, while they may also serve as alternative reagents in various biotechnological systems (e.g. for purifying, immobilizing or “labeling” biomolecules) that employ special biotinylated probes in combination with biotin-binding proteins (e.g. avidin, streptavidin). From a different point of view, anti-biotin antibodies can be considered “model” anti-hapten antibodies, since their functional binding characteristics for the corresponding hapten (biotin) can be easy and reliably evaluated by using avidin or streptavidin as control binding biomolecules. The antibodies for biotin were developed against the synthetic derivative biotin-aminocaproic acid-lysine (BAL), which was conjugated to bovine thyroglobulin via glutaraldehyde and then used for immunizing New Zealand white rabbits. BAL was synthesized on a commercially available resin following the Fmoc-solid phase strategy, which is widely applied to the field of peptide synthesis. This approach has greatly facilitated the experimental procedure, decreased the undesirable side-reactions (due to the presence of special protecting groups in each of the “building moieties” of BAL), overcame the necessity for intermediate purification steps and led to a final product of high purity and yield. The aminocaproic acid-lysine “long bridge” was used in order to keep the hapten far apart from the carrier protein, thus “projecting” it to the immunological system of the host animal. Lysine was selected due to its Nε-amino group, through which BAL can be conjugated -via glutaraldehyde- to the carrier protein molecule. The anti-BAL antibodies were evaluated in an ELISA system, which was developed in-house. A biotin / polylysine-dendrimer conjugate was used for immobilizing biotin on the ELISA microwells. The polylysine-dendrimer was synthesized -for the first time, as a part of the experimental work of this Thesis- following the Fmoc-solid phase strategy and using Fmoc-Lys(Nε-Fmoc)-OH and Fmoc-Lys(Nε-Boc)-OH as building blocks. The titer of the anti-BAL antibodies was ~ 1:50,000. Displacement curves were obtained in the presence of increasing concentrations of not only BAL and BA but also free biotin (10 ng/mL - 10 μg/mL). In the frames of the Thesis, an ELISA-type, enzyme-binding assay was also developed, in which the biotin / polylysine-dendrimer conjugate and streptavidin-HRP were used. In this assay, a displacement curve was obtained in the presence of very low biotin concentrations (100 - 800 pg/mL). The displacement curves of the ELISA and the ELISA-type, enzyme-binding assay were applied to the determination of biotin in serial dilutions of a commercially available pharmaceutical preparation containing biotin. The anti-BAL antibodies were applied, in parallel with streptavidin, to preliminary immunocytology experiments with HeLa cells, which led to a clear immunostaining of the cell cytoplasm, while the cell nucleus was not stained. The anti-BAL antibodies were also applied, in parallel with streptavidin, to the western-blot analysis of HeLa and MDA-MB-231 cell lysates, leading to a similar pattern with that of streptavidin. By following a similar approach with the above described one, New Zealand white rabbits were immunized against the synthetic derivative carnitine-aminocaproic acid-lysine (CAL), aiming at the development of antibodies for the natural hapten carnitine, due to its biological importance as well as to the lack of any commercially available antibodies for it. In this case, however, the antibodies developed recognized the synthetic derivative CAL but not free carnitine. Antibodies specific for carnitine were not developed when other carnitine derivatives were used for immunization, either. This finding along with the above mentioned lack of commercially available anti-carnitine antibodies as well as of any (but just one) relevant articles in the literature led us to speculate that these negative results may be attributed to low intrinsic antigenicity of carnitine rather than to the design of CAL. Overall, we strongly believe that the possibility of using synthetic derivatives of the general type “hapten-aminocaproic acid-lysine” in order to develop efficient and specific antibodies for carboxyl-bearing haptens should be further investigated.

Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αναπτύχθηκαν και αξιολογήθηκαν σε ποικίλα ανοσοχημικά συστήματα, πολυκλωνικά αντισώματα για τη βιοτίνη, μια μικρομοριακή ένωση (απτένιο) με μεγάλο βιοχημικό αλλά και βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον. Τα αντισώματα εναντίον βιοτίνης θεωρούνται σημαντικά βιοαναλυτικά εργαλεία, εφόσον μπορούν i) να χρησιμοποιηθούν στην έρευνα επί της βιοτίνης και των φυσικών βιοτινυλο-μακρομορίων του οργανισμού, ii) να λειτουργήσουν ως εναλλακτικά αντιδραστήρια σε ποικίλα συστήματα βιοτεχνολογίας (π.χ. συστήματα καθαρισμού, «ακινητοποίησης» ή ανίχνευσης βιομορίων), που χρησιμοποιούν συνδυασμό ειδικών βιοτινυλιωμένων αντιδραστηρίων με πρωτεΐνες που δεσμεύουν τη βιοτίνη (π.χ. αβιδίνη, στρεπταβιδίνη). Από μία διαφορετική οπτική γωνία, τα αντισώματα εναντίον βιοτίνης μπορούν να θεωρηθούν ως «πρότυπα αντισώματα εναντίον απτενίου», μιας και η λειτουργική δεσμευτική τους ικανότητα για το αντίστοιχο απτένιο μπορεί να αξιολογηθει εύκολα και αξιόπιστα χρησιμοποιώντας την αβιδίνη ή τη στρεπταβιδίνη ως θετικό μάρτυρα. Τα αντισώματα για τη βιοτίνη αναπτύχθηκαν εναντίον ειδικού συνθετικού παραγώγου, του παραγώγου βιοτίνη-αμινοκαπροϊκό οξύ-λυσίνη (BAL),το οποίο συζεύχθηκε με βόειο θυρεοσφαιρίνη, μέσω γλουταραλδεΰδης, και χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοποίηση λευκών κουνελιών Νέας Ζηλανδίας. Το παράγωγο BAL συνετέθη επί εμπορικά διαθέσιμης ρητίνης ακολουθώντας την Fmoc-στρατηγική σύνθεσης σε στερεή φάση, η οποία εφαρμόζεται ευρύτατα στη σύνθεση πεπτιδίων. Η προσέγγιση αυτή απλούστευσε εξαιρετικά την πειραματική διαδικασία, περιόρισε τις ανεπιθύμητες αντιδράσεις (λόγω της παρουσίας προστατευτικών ομάδων στους επί μέρους «δομικούς λίθους» της σύνθεσης), υπερέβη την αναγκαιότητα ενδιάμεσων σταδίων καθαρισμού και οδήγησε σε τελικό προϊόν υψηλής καθαρότητας και απόδοσης. Η «μακρά γέφυρα» αμινοκαπροϊκού οξεος - λυσίνης χρησιμοποιήθηκε για να απομακρύνει τα μόρια του απτενίου από τα μόρια της φέρουσας πρωτεΐνης, καθιστώντας τα περισσότερο προσιτά στο ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού-ξενιστή. Η λυσίνη επελέγη λόγω της Νε-αμινομάδας που περιέχει η πλευρική της αλυσίδα, μέσω της οποίας το τελικό παράγωγο BAL μπορεί να συζευχθεί, παρουσία γλουταραλδεΰδης, στη φέρουσα πρωτεΐνη. Τα αντι-BAL αντισώματα αξιολογήθηκαν σε σύστημα ELISA, που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο. Σύζευγμα βιοτίνης - πολυλυσινικού δενδριμερούς χρησιμοποιήθηκε για την «ακινητοποίηση» (immobilization) της βιοτίνης στα φρεάτια ELISA. Το πολυλυσινικό δενδριμερές συνετέθη για πρώτη φορά στα πλαίσια της παρούσας διατριβής ακολουθώντας τη στρατηγική της Fmoc-σύνθεσης σε στερεή φάση και χρησιμοποιώντας Fmoc-Lys(Nε-Fmoc)-OH και Fmoc-Lys(Nε-Boc)-OH ως δομικούς λίθους. Ο τίτλος των αντι-BAL αντισωμάτων ήταν 1 : 50.000. Καμπύλες εκτόπισης ελήφθησαν παρουσία αυξανομένων συγκεντρώσεων των συνθετικών παραγώγων BAL και ΒΑ αλλά και παρουσία ελεύθερης βιοτίνης (10 ng/mL - 10 μg/mL). Στα πλαίσια της διατριβής αναπτύχθηκε επίσης πρωτόκολλο καμπύλης εκτόπισης με ενζυμοδεσμευτική μέθοδο, τύπου ELISA, στο οποίο χρησιμοποιήθηκαν βιοτίνη ακινητοποιημένη στα φρεάτια υπό τη μορφή συζεύγματος με το συνθετικό πολυλυσινικό δενδριμερές και στρεπταβιδίνη επισημασμένη με το ένζυμο HRP. Κατά την εφαρμογή της μεθόδου, παρατηρήθηκε εκτόπιση της επισημασμένης στρεπταβιδίνης από τα φρεάτια ELISA παρουσία πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων βιοτίνης (100 pg/mL-800 μg/mL). Οι καμπύλες εκτόπισης της ELISA και της ενζυμοδεσμευτικής μεθόδου, τύπου ELISA χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων βιοτίνης σε διαδοχικές αραιώσεις φαρμακευτικού σκευάσματος της βιταμίνης που κυκλοφορεί στο εμπόριο. .............................................................................................