Αξιολόγηση του ενζυμικού και μικροβιακού συστήματος του μύκητα Fusarium oxysporum για την βιομετατροπή κυτταρινούχων και ημικυτταρινούχων αγροτοβιομηχανικών παραπροϊόντων

Abstract

The ability of the filamentous fungus Fusarium oxysporum F3 to convert celllulosic and hemicellulosic agro-industrial residues to ethanol implementing a consolidated bioprocess was evaluated. The effectiveness of the enzymatic system of the microorganism to hydrolyze cellulose and hemicellulose and the metabolism of the sugars derived from hydrolysis by the microbial system of the fungus were studied. The functional stages (growth stage, cellulose and hemicellulose hydrolysis and fermentation of produced sugars) of the consolidated process were studied separately in order to determinate the factors affecting each stage. Brewers spent grain and hydrothermally treated wheat straw were used as exemplar hemicellulosic and cellulosic substrates respectively. The optimization of the cultivation conditions focused on the cultivation technique and on the carbon source used. Scaling up experiments were performed in bioreactors. Stirred tank bioreactors (20 L) and horizontal agitated drum bioreactors (500 g) were used for submerged and solid state cultivation respectively. The optimal growth and the optimal enzyme production were achieved when Fusarium oxysporum was grown under submerged conditions, using brewers spent grain and corn cobs in a ratio 2 : 1 and in final concentration 40g L-1, as the carbon source. The effects of a large number of factors affecting hydrolysis of cellulose and hemicellulose were incorporated in two mathematical models describing the hydrolysis of cellulose and hemicellulose respectively. The mathematical models expressed sugars production rates in function of initial experimental conditions (initial substrate concentration and enzyme dosage) and fitted very well the experimental data. The predictions of the models about certain initial conditions were used for a successful experimental design of the consolidated bioprocess. Ethanol production stage was performed in stirred tank bioreactors. The fermentation study, through an optimization process, determinate the crucial points of the process, using the conclusions derived from the hydrolysis study. The cellulolytic activities present during the bioconversion process and the inhibitory effects of cellulose degradation products on cellulolytic activities were found to be the major factors affecting the conversion of cellulose to ethanol. The significance of a consolidated bioconversion process ensuring the direct assimilation of these products was shown. On the other hand, it was the structure and the composition of spent grain’s hemicellulose that was proved to be the bottleneck during the conversion of brewers spent grain to ethanol. The extremely high ratio of arabinose to xylose in the composition of this material was found to be the main obstacle to an effective conversion of the hemicellulose content, implementing a consolidated bioprocess by Fusarium oxysporum

Η δυνατότητα του φυσικού στελέχους F3 του μύκητα Fusarium oxysporum να μετατρέψει αποτελεσματικά κυτταρινούχα και ημικυτταρινούχα παραπροϊόντα σε αιθανόλη, στα πλαίσια μίας ενοποιημένης διεργασίας βιομετατροπής (consolidated bioprocessing) αξιολογήθηκε τόσο ως προς το ενζυμικό του σύστημα, όσο και ως προς την ικανότητα μεταβολισμού των προϊόντων της υδρόλυσης των υποστρωμάτων. Οι λειτουργικές φάσεις της βιομετατροπής (Ανάπτυξη του μικροοργανισμού και παραγωγή υδρολυτικών ενζύμων, σακχαροποίηση της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης και ζύμωση των σακχάρων που παράγονται σε αιθανόλη) μελετήθηκαν μεμονωμένα προκειμένου να διερευνηθούν οι παράγοντες που επηρεάζουν την κάθε μία. Το υπόλειμμα βύνης και το υδροθερμικά κατεργασμένο άχυρο σίτου χρησιμοποιήθηκαν σαν πρότυπα ημικυτταρινούχα και κυτταρινούχα υλικά αντίστοιχα. Η βελτιστοποίηση της φάσης ανάπτυξης εστιάστηκε στην τεχνική καλλιέργειας και στην πηγή άνθρακα καθώς οι βέλτιστες συνθήκες αναφορικά με παραμέτρους όπως η θερμοκρασία επώασης, τιμή του pH της καλλιέργειας και η χρησιμοποιούμενη πηγή αζώτου έχουν καθοριστεί στο παρελθόν. Οι τιμές των παραγόμενων ενζυμικών ενεργοτήτων αλλά και η ανάπτυξη του μικροοργανισμού παρέμειναν στα ίδια επίπεδα κατά τα πειράματα κλιμάκωσης της παραγωγής που πραγματοποιήθηκαν σε βιοαντιδραστήρες 20 L και 500 g για τη βυθισμένη και τη στερεή καλλιέργεια αντίστοιχα Η αξιολόγηση του παραγόμενου ενζυμικού συστήματος κατά την υδρόλυση της κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης των υποστρωμάτων που μελετήθηκαν, πραγματοποιήθηκε αναλύοντας ένα πλήθος παραγόντων. Οι επιδράσεις τους εκφράστηκαν μαθηματικά και συνδυάστηκαν σε μοντέλα που περιέγραψαν πολύ ικανοποιητικά την παραγωγή σακχάρων σε συνάρτηση με την αρχική ποσότητα υποστρώματος και την ενζυμική δόση που χρησιμοποιείτο. Οι προβλέψεις των μαθηματικών μοντέλων χρησιμοποιήθηκαν για τον σχεδιασμό των ενοποιημένων διεργασιών βιομετατροπής. Η μελέτη της φάσης παραγωγής αιθανόλης πραγματοποιήθηκε εξολοκλήρου σε βιοαντιδραστήρες. Η εφαρμογή των συμπερασμάτων που προέκυψαν από τη μελέτη της ανάπτυξης και της υδρόλυσης αλλά και η βελτιστοποίηση των συνθηκών της ζύμωσης, επέτρεψε τον καθορισμό των κρίσιμων σημείων της βιομετατροπής. Η παρεμποδιστική δράση των προϊόντων της υδρόλυσης και η ποσότητα των ενζύμων φάνηκε ότι καθορίζουν την απόδοση βιομετατροπής της κυτταρίνης, αποδεικνύοντας την σημασία της άμεσης, κατά την ενοποιημένη βιομετατροπή, κατανάλωσης της γλυκόζης που σχηματίζεται. Αντιθέτως οι δομικές ιδαιτερότητες της ημικυτταρίνης του υπολείμματος βύνης και πιο συγκεκριμένα, ο υψηλός λόγος αραβινόζης / ξυλόζης στη σύστασή της, φάνηκε να είναι ο καθοριστικός παράγοντας στην απόδοση της βιομετατροπής της ημικυτταρίνης σε αιθανόλη από τον Fusarium oxysporum στα πλαίσια της ενοποιημένης διεργασίας.