Μελέτη της αγγειογένεσης και της λεμφαγγειογένεσης στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του στόματος, με ανοσοϊστοχημικές τεχνικές

Abstract

Angiogenesis is the propelling force for tumor growth and metastatic dissemination in solidneoplasms. This process is tightly controlled by numerous positive and negative angiogenic factorsand their receptors, the interaction of which regulates the cascades enabled in tumorneovascularization. Among the factors causing tumor angiogenesis, vascular endothelial growth factor (VEGF) is considered as a leading candidate. VEGF induces the proliferation, differentiation, and migration of vascular endothelial cells, increases the permeability of the capillaries, and also enhances the survival of endothelial cells by preventing their apoptosis. It has been proposed that the quantification of angiogenesis by the assessment of microvascular density (MVD), as well as theevaluation of VEGF immunohistochemical expression may have prognostic value in a number ofmalignancies, including head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Lymph node metastasis is a frequent reason for adverse clinical outcome in many epithelial neoplasms, including HNSCC. The mechanisms underlying the capability of epithelial neoplasms to metastasize via lymphatic vessels have not yet been fully elucidated. There is great debate about whether cancer cells can metastasize by expansion and invasion of pre-existing peritumoral lymphatics or by the formation and invasion of new lymphatics within tumours (lymphangiogenesis). Currently, researchers probe into the mechanisms of lymphangiogenesis. Central to these efforts was the discovery of lymphatic endothelium markers, such as LYVE-1, the antibody against podoplanin, D2-40,prox-l andVEGFR-3.We aimed to study angiogenesis and lymphangiogenesis in 81 formalin-fixed, paraffin embedded archival tissue blocks of HNSCC specimens, applying immunohistochemical techniques. We evaluated the expression of VEGF and its receptors (VEGFR-1 and VEGFR-2) by squamouscancer cells and assessed MVD with the use of both the traditional endothelial markers CD31 andCD34, as well as with the use of the newly proposed marker CD 105 (endoglin). We also addressed the impact of hypoxia-induced angiogenic pathway by examining the expression of HIF-la. Furthermore, we studied lymphangiogenesis, using immunostaining for the specific lymphatic endothelium marker podoplanin, assessed intratumoral and peritumoral lymphatic density (ILD and PLD), and also quantified lymphatic invasion. Active lymphangiogenesis was examined with double staining with podoplanin and the cell proliferation marker Ki-67. We also addressed the diagnostic accuracy of two of the so called "specific lymphatic endothelial markers", podoplanin and D2-40. Moreover, we assessed the expression of VEGF-C and its possible correlation with COX-2 expression, in order to investigate the impact of the prostaglandin pathway in lymphangiogenesis. Finally, we evaluated the correlation between cell-cell adhesion and lymphangiogenesis by examining the expression of dysadherin and E-cadherin along with lymphatic density. Dysadherin is a recently characterized cancer-associated cell membrane glycoprotein that acts as an "anti-adhesion molecule" by deactivation of E-cadherin in a posttranscriptional manner. VEGF overexpression was associated with advanced clinical stage, positive surgical margins and worse overall survival. The prognostic significance of VEGF in HNSCC was further supported bythe synthesis of the results of all the studies addressing this issue, with the method of meta-analysis. The estimated risk of death in 2 years was 1.88 fold higher in the VEGF-positive patients (95% CI: 1.43-2.45, p<0.001, random effects calculations). VEGF overexpression was also significantly associated with higher MVD, when the last was determined with CD 105. CD 105 was intensively expressed in intratumoral blood vessels, whilst vessels at the adjacent normal mucosa were only rarely expressing this marker. MVD determined with CD105 (but not with CD34 or CD31) was associated with worse overall survival in our cohort of patients. The investigation for VEGF receptors revealed the existence of these receptors in cancer cell membranes, besides vascular endothelium. High expression of VEGF was strongly correlated with high expression of VEGFR-2 (but not VEGFR-1) on the cancer cells (pO.001). The co-overexpression of both the protein and VEGFR-2 was associated with higher tumor proliferation rate, as indicated with ki-67 (p<0.001). These results suggest that an autocrine VEGF loop, mediated via VEGFR-2, probably exists in HNSCC. Squamous cancer cells probably produce VEGF not only to induce neoplastic angiogenesis, but also to enhance their uncontrolled proliferation. Studying the hypoxia-induced tumor angiogenic pathway, we observed a statistically significant association between HIF-la and VEGF expression in tumors located in the lower lip, but not in the rest. These findings support the hypothesis that tumor angiogenesis is closely related, but not strictly dependent, on the hypoxic conditions of tumors' microenvironment. Double staining with podoplanin / ki-67 revealed the existence of proliferating intratumoral lymphatics, in which tumour emboli were occasionally observed. High ILD and PLD were both significantly associated with the presence of lymph node metastasis (x2 test, ρ < 0.001 and ρ = 0.007, respectively) and there was a significant correlation between high ILD and lymphatic invasion. Patients with higher intratumoral lymphatic density exhibited shorter overall survival. These results indicate that lymphangiogenesis indeed occurs in HNSCC; that newly formed vessels are targets of invasion by cancer cells; and that intratumoral lymphatic density might be used as a criterion to separate patients at higher risk of an adverse clinical outcome. Reservations about the existence of lymphangiogenesis in tumors are boosted by the absence of quantitative data about the diagnostic accuracy of lymphatic endothelium markers. We therefore compared the diagnostic accuracy of the antibody against podoplanin and the commercially available D2-40, employing Bayesian statistics to account for the absence of a gold standard. Both antibodies had extremely high specificity (99.7% and 98.8% for podoplanin and D2-40, respectively) and very high sensitivity (92.6% and 97.3% for podoplanin and D2-40, respectively). These results suggest that both antibodies are excellent lymphatic endothelium markers. Results for VEGF-C revealed that the expression of this protein marches with COX-2 overexpression (p<0.001), and both are strongly correlated with the presence of lymph node metastasis (p<0.001). Studies performed after the publication of our results confirmed these observations and support the hypothesis for a prostaglandin-mediated lymphangiogenic pathway, in which COX-2 stimulates VEGF-C up-regulation. Finally, the examination of cell-cell adhesion along with the micro-lymphovasculature environment in HNSCC revealed, besides an impressive reverse association between increased dysadherin expression and decreased E-cadherin expression (x"pO.001), a strong association between higher dysadherin expression with high ILD (x~, ρ = 0.001) and the presence of lymph node metastasis (x2 p=0.02). Surprisingly, dysadherin-positive cancer cellsusually gathered around areas of high intratumoral lymphatic vessel concentration, surrounding andinvading small intratumoral lymphatics. Thus, the loss of intercellular adhesiveness and increaseddysadherin expression seems to be related to lymphangiogenesis in HNSCC. In summary, angiogenesis and lymphangiogenesis seem to play a crucial role in HNSCC. Further understanding of the mechanisms underlying these procedures will aid the incorporation of novel prognostic tools into clinical practice and help the development of drugs targeting several of their critical steps in order to improve patients' outcome.

Η αγγειογένεση στα νεοπλάσματα είναι μια πολύπλοκη διαδικασία με την οποία τα κύτταρα του όγκου εξασφαλίζουν την επάρκεια τους σε θρεπτικές ουσίες, ενώ παράλληλα παίζει ρόλο στηνεκδήλωση των μεταστάσεων. Στη διαδικασία αυτή ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας(VEGF) έχει κεντρικό ρόλο. Σε πολλά νεοπλάσματα η εκδήλωση λεμφαδενικών μεταστάσεων είναι το πρώτο βήμα στην εκδήλωση επιθετικού φαινοτύπου. Υπάρχει μεγάλη διχογνωμία για το αν τα κακοήθη νεοπλάσματα επάγουν τη δημιουργία νέων λεμφαγγείων (λεμφαγγειογένεση) ή αν χρησιμοποιούν τα ήδη υπάρχοντα πέριξ του όγκου λεμφαγγεία για να εκδηλώσουν λεμφαδενικές μεταστάσεις. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η αξιολόγηση τόσο της αγγειογένεσης, όσο και της λεμφαγγειογένεσης στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του στόματος, και η αναζήτηση συγκεκριμένων προγνωστικών δεικτών μεταξύ των παραγόντων που εμπλέκονται στις διαδικασίες αυτές. Σε 81 δείγματα ακανθοκυτταρικού καρκινώματος μελετήσαμε την έκφραση του VEGF και των υποδοχέων του, καταγράψαμε τη μικροαγγειακή πυκνότητα και εξετάσαμε το αγγειογενετικό μονοπάτι της υποξίας. Διερευνήσαμε την ύπαρξη ενεργούς λεμφαγγειογένεσης, καταγράψαμε τη λεμφαγγειακή πυκνότητα και αξιολογήσαμε την ακρίβεια δύο λεμφαγγειακών δεικτών. Μελετήσαμε ακόμα την έκφραση του VEGF-C και τη συσχέτιση του με την έκφραση της COX-2. Τέλος, εξετάσαμε την πιθανή σχέση της μείωσης της κυτταρικής συνοχής με την λεμφαγγειογένεση.Η υπερέκφραση του VEGF συσχετίστηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό με προχωρημένο κλινικό στάδιο, τάση διήθησης των χειρουργικών ορίων και χειρότερη ολική επιβίωση των ασθενών. Η προγνωστική αξία του VEGF επιβεβαιώθηκε και με ποσοτική σύνθεση των αποτελεσμάτων προηγούμενων μελετών με τη μέθοδο της μετα-ανάλυσης. Συσχετίστηκε επίσης με υψηλήμικροαγγειακή πυκνότητα, μόνο όμως όταν αυτή καταγραφόταν με τη χρήση του CD 105. Ο εν λόγω δείκτης βρέθηκε να εκφράζεται έντονα κυρίως στα εντός του όγκου νεοπλασματικά νεοαγγεία, σε αντίθεση με τους συμβατικούς δείκτες CD34 και CD31 που αναδείκνυαν με την ίδια ένταση τόσο τα νεοπλασματικά, όσο και τα φυσιολογικά προϋπάρχοντα αγγεία. Η μικροαγγειακή πυκνότητα είχεπρογνωστική αξία όταν καταγραφόταν με το CD 105. Οι υποδοχείς του VEGF βρέθηκε ναεκφράζονται από τα νεοπλασματικά κύτταρα του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος, και η έκφρασητου VEGFR-2 συνδέθηκε με υπερέκφραση του VEGF και αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό.Είναι πιθανή η ύπαρξη ενός αυτοκρινούς μηχανισμού με τον οποίο τα καρκινικά κύτταρα παράγουντον VEGF όχι μόνο για να διεγείρουν την νεοπλασματική αγγειογένεση, αλλά και για να τονχρησιμοποιήσουν τα ίδια ως αυξητικό παράγοντα, για να επάγουν τον δικό τους ανεξέλεγκτοκυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η έκφραση του HIF-la συσχετίστηκε με την υπερέκφραση του VEGF,αυτό όμως δεν ίσχυε για όλες τις εντοπίσεις της πρωτοπαθούς εστίας, παρά μόνο στο κάτω χείλος.Αυτό δείχνει ότι η υποξία είναι μεν ο κύριος, αλλά όχι ο αποκλειστικός ρυθμιστής της αγγειογένεσης.Η χρήση του ειδικού λεμφαγγειακού δείκτη podoplanin μαζί με το ki-67 αποκάλυψε την ύπαρξη λεμφαγγείων σε φάση πολλαπλασιασμού εντός του όγκου, επιβεβαιώνοντας προηγούμενεςπαρατηρήσεις ότι όντως υφίσταται ενεργός λεμφαγγειογένεση στο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα. Τανεοσχηματιζόμενα λεμφαγγεία βρέθηκε να αποτελούν στόχους εισβολής για τα νεοπλασματικάκύτταρα ενώ η εντός του όγκου αυξημένη λεμφαγγειακή πυκνότητα συσχετίστηκε με την παρουσίαλεμφαδενικών μεταστάσεων και με μειωμένη ολική επιβίωση. Η διερεύνηση της διαγνωστικήςακρίβειας της podoplanin και του εμπορικά διαθέσιμου D2-40 κατέδειξε ότι και τα δύο αντισώματαέχουν άριστη ακρίβεια στην ανίχνευση λεμφαγγείων. Η υπερέκφραση του VEGF-C συσχετίστηκε μετην παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (όπως είχε αναφερθεί και από προηγούμενες μελέτες) αλλά και με την υπερέκφραση της COX-2. Η παρατήρηση αυτή πιθανολογεί συμμετοχή του μοριακού μηχανισμού των προσταγλανδινών στη λεμφαγγειογένεση. Μεταγενέστερες δημοσιεύσεις φαίνεται να επιβεβαιώνουν αυτή την παρατήρηση. Τέλος, η μειωμένη κυτταρική προσκόλληση, όπως αυτή αξιολογήθηκε με την υποέκφραση της E-cadherin και την υπερέκφραση της dysadherin συσχετίστηκε με αυξημένη λεμφαγγειακή πυκνότητα, και με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων. Παρατηρήσαμε επίσης την ύπαρξη νεοπλασματικών κυττάρων με έντονη έκφραση της dysadherin να περικυκλώνουν και να εισβάλλουν σε μικρά λεμφαγγεία, κάτι που ενισχύει την υπόθεση της αλληλεπίδρασης της μείωσης της κυτταρικής συνοχής με τη λεμφαγγειογένεση.Συμπερασματικά, η αγγειογένεση και η λεμφαγγειογένεση διαδραματίζουν σημαντικό ρόλοστο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, και η αναστολή τους ίσως αποδειχθεί ιδιαίτερα σημαντική στομέλλον για τη θεραπευτική αντιμετώπιση των ασθενών.