Παραγωγή, κρυστάλλωση και προσδιορισμός του single chain recombinant PvuII περιοριστικού ενζύμου

Abstract

Restriction endonuclease PvuII from Proteus vulgaris has been converted from its wild-type homodimeric form into the enzymatically active single-chain variant scPvuII by tandemly joining the two subunits through the peptide linker GlySerGlyGly. scPvuII was created for the development of programmed restriction endonucleases (for highly specific DNA cleavage) and for application in gene therapy. It was expressed and purified in satisfactory quantities for the necessary structural and biological studies. This PhD thesis is divided into three major sections, which contain the crystallographic study of scPvuII, the Small Angle X-ray Scattering (SAXS) study of scPvuII and its complex with DNA and finally, the study concerning the protein-DNA interactions in catalytic and binding conditions with EMSA techniques. The free protein was crystallized and the crystals were measured using X-rays. The best crystal was diffracting to the resolution of 2.35Å. Structure determination was achieved from data collected from that crystal, which was hemihedrally twinned and belonged to spacegroup P4₂. scPvuII is 22.60° more closed than the R.PvuII. In solution, there are two forms of scPvuII: one is closed (like the crystallographic one) and one open (like the R.PvuII), as it has been proved by gel filtration and SAXS experiments. The complex with cognate DNA has not yet been crystallized, but it is confirmed to exist by SAXS in solution, in molar ratio 1:1 with 16 bp cognate DNA in the presence of Ca⁺². EMSA experiments confirmed the activity of the modified enzyme upon binding and catalysis of cognate DNA. This knowledge will become the base to support further research on scPvuII, as well as to design and produce asymmetric Type II restriction enzymes, recognising asymmetric sequences of DNA, catalysing with a middle cut and leaving blunt ends.

Η single chain cPvuII είναι ένα τεχνητό περιοριστικό ένζυμο, που προέκυψε από την μετατροπή της περιοριστικής ενδονουκλεάσης R.PvuII (προέρχεται από το βακτήριο Proteus vulgaris) από διμερές μόριο σε μονομερές μέσω ενός συνδετικού ολιγοπεπτιδίου 4 αμινοξικών καταλοίπων GlySerGlyGly, το οποίο συνδέει τις δύο υπομονάδες της R.PvuII μεταξύ τους. Σχεδιάσθηκε με στόχο την ανάπτυξη προγραμματιζόμενων περιοριστικών ενζύμων (με υψηλή εξειδίκευση στην κατάλυση του DNA) και αξιοποίηση τους στη γονιδιακή θεραπεία. Εκφράσθηκε και απομονώθηκε σε ικανοποιητικές ποσότητες για τις απαραίτητες δομικές και βιολογικές μελέτες. Η παρούσα διδακτορική διατριβή, διακρίνεται σε τρεις μεγάλες ενότητες, οι οποίες περιλαμβάνουν την κρυσταλλογραφική μελέτη της scPvuII, την μελέτη σκέδασης ακτίνων-Χ από διάλυμα σε μικρές γωνίες (SAXS) της scPvuII και του συμπλόκου μορίου της με συγγενές DNA και τέλος την μελέτη των αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης με DNA σε συνθήκες κατάλυσης και πρόσδεσης με την τεχνική EMSA. Η ελεύθερη πρωτεΐνη κρυσταλλώθηκε και οι κρύσταλλοι μετρήθηκαν με ακτίνες- X, με τον καλύτερο από αυτούς να σκεδάζει στη διακριτική ικανότητα των 2.35Å. Από αυτόν τον κρύσταλλο, που ανήκει στη χωρο-ομάδα συμμετρίας Ρ4₂, προσδιορίσθηκε η κρυσταλλογραφική δομή της scPvuII, η οποία είναι κατά 22.60° πιο κλειστή από την R.PvuII. Στη διαλυτή φάση, η scPvuII υπάρχει σε δύο μορφές: μια κλειστή (όπως η κρυσταλλογραφική) και μια ανοικτή (όπως η R.PvuII), όπως έχει επιβεβαιωθεί από πειράματα χρωματογραφίας μοριακής διήθησης και SAXS. Με την μέθοδο SAXS διερευνήθηκε ο σχηματισμός του συμπλόκου μορίου με DNA, το οποίο δεν έχει ακόμα κρυσταλλωθεί, αλλά στο διάλυμα βρέθηκε ότι σχηματίζεται σε στοιχειομετρική αναλογία μορίων 1:1 με 16bp συγγενές DNA. Τα αποτελέσματα της τεχνικής EMSA επιβεβαιώνουν την διατήρηση της ενεργότητας του τεχνητού ενζύμου ως προς την πρόσδεση και την κατάλυση συγγενούς DNA. Οι γνώσεις αυτές θα αποτελέσουν το υπόβαθρο πάνω στο οποίο θα στηριχθεί η περαιτέρω έρευνα για την scPvuII, καθώς επίσης ο σχεδιασμός και η παραγωγή ασύμμετρων περιοριστικών ενζύμων τύπου II, που θα αναγνωρίζουν ασύμμετρες αλληλουχίες DNA, τις οποίες θα κόβουν στο μέσο αφήνοντας τυφλά άκρα.