Μελέτη της δράσης της προθυμοσίνης α στην επαγωγή ανοσολογικών απαντήσεων από κυτταρικούς υποπληθυσμούς in vitro και in vivo

Abstract

The purpose of the present doctoral thesis was the study on the mechanism of action of Prothymosin α in stimulating lymphocyte reactions. Initially, in order to identify the intracellular protein-targets downstream lymphocyte activation with Prothymosin a, as well as the signalling pathways it triggers, we performed proteomic analysis techniques on lymphocyte cytoplasmic fractions. Our results showed that Prothymosin α enhances immune reactions via monocyte stimulation downstream toll-like receptors. Next, aiming at characterizing the immunodrastic sequence along Prothymosin a's polypeptide backbone, we isolated its tryptic fragments and studied their ability to stimulate T-cell proliferation and NK-cell cytotoxicity. Using synthetic peptides homologous to the immunologically active fragments of the polypeptide, we observed that Prothymosin a's immunodrastic centre lies at the carboxyl terminus, residues 100-109, with aminoacid sequence TKKQKTDEDD. Furthermore, Prothymosin α and TKKQKTDEDD peptide were shown capable of promoting dendritic cell maturation in vitro, and enhancing tumor-specific responses in C57BL/6 mice, subjected to a therapeutic immunotherapy protocol using Prothymosin α or the TKKQKTDEDD peptide in combination with tumor specific antigens. Finally, using ATR FT-IR spectroscopy we investigated on the structural characteristics of the drastic TKKQKTDEDD peptide and noticed that it adopts antiparallel beta-sheet secondary structure.

Σκοπός μας ήταν η μελέτη του μηχανισμού δράσης της Προθυμοσίνης α στη διέγερση λεμφοκυτταρικών αποκρίσεων. Αρχικά, για να μελετήσουμε τις ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες-στόχους της ενεργοποίησης των λεμφοκυττάρων με Προθυμοσίνη α και να αποτυπώσουμε τα μονοπάτια σηματοδότησης που διεγείρει, έγινε πρωτεωμική ανάλυση σε κυτταροπλασματικά κλάσματα λεμφοκυττάρων. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η Προθυμοσίνη α επάγει ανοσολογικές αποκρίσεις διεγείροντας τα μονοκύτταρα καταρροϊκά των υποδοχέων τύπου-toll. Σε επόμενο βήμα, και προκειμένου να εντοπίσουμε την ανοσοδραστική αλληλουχία της Προθυμοσίνης α, απομονώσαμε τρυπτικά θραύσματα του πολυπεπτιδίου και μελετήσαμε τη ικανότητα τους να διεγείρουν τον Τ-κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κυτταροτοξικότητα των ΝΚ-κυττάρων. Με την χρήση συνθετικών πεπτιδίων ομόλογων προς τα ανοσολογικά ενεργά θραύσματα του πολυπεπτιδίου, παρατηρήσαμε ότι το ανοσοδραστικό κέντρο της Προθυμοσίνης α εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό της άκρο, κατάλοιπα 100-109, με αμινοξική αλληλουχία TKKQKTDEDD. Επιπλέον, η Προθυμοσίνη α και το πεπτίδιο TKKQKTDEDD φάνηκαν ικανά να επάγουν την ωρίμανση δενδριτικών κυττάρων in vitro, αλλά και να ενισχύουν την εκδήλωση ογκοειδικών απαντήσεων σε ποντίκια της φυλής C57BL/6, στα οποία εφαρμόσαμε θεραπευτικό πρωτόκολλο ανοσοθεραπείας χρησιμοποιώντας Προθυμοσίνη α ή το πεπτίδιο TKKQKTDEDD σε συνδυασμό με ειδικά αντιγόνα του όγκου. Τέλος, με φασματοσκοπία υπερερύθρου ATR FT-IR διερευνήσαμε τα δομικά χαρακτηριστικά του πεπτιδίου TKKQKTDEDD και διαπιστώσαμε ότι σχηματίζει δομές αντιπαράλληλων β-πτυχωτών επιφανειών.