Μηχανισμοί σηματοδότησης που εμπλέκονται στις φυσιολογικές αποκρίσεις των καρδιακών κυττάρων στις μεταβολές του pH

Abstract

The aim of the present study was the investigation of the effects of extracellular pH changes and conditions that are associated with alterations of intracellular pH, like the effect of growth factors and oxidative stress, in the activation of the MAPK signalling pathways in heart experimental models. The biological material used included the isolated perfused heart of the amphibian Rana ndibunda, the H9c2 rat cardiac myoblasts and the isolated neonatal rat ventricular myocytes. For the purposes of the study biochemical, immunological, histochemical, molecular and radiochemical methods were used. The results showed that alkalosis, acidosis and the system of xanthine/xanthine oxidase activate p38-MAPK in the amphibian heart, the last through the production of superoxide anion The alkalosisinduced p38-MAPK activation depends on the function of NHE1 and Na⁺/K⁺-ATPase, whereas both this stimulus and the xanthine/xanthine oxidase system increase the phosphorylation levels of two proteins that exist downstream of p38-MAPK, MAPKAPK2 and HSP27. From the experiments in H9c2 cells it was found that extracellular alkalosis induces an increase in intracellular pH which depends on both NHE1 and ERKs Incubation of cells with a medium of pH value pH 8,5 activates p38-MAPK, JNKs and ERKs which, as it was shown in the case of the amphibian, it depends on NHE1. Activation of ERKs as well as of the kinase PKB is also observed in isolated neonatal rat ventricular cardiomyocytes during the action of growth factors and peptide hormones. In H9c2 cells and during alkalosis (pH 8,5), JNKs phosphorylate the transcription factor AP-1 subunit c-Jun and the antiapoptotic protein Bcl-2, results suggesting that these kinases control gene expression and cell survival. On the other hand, ERKs and p38-MAPK converge at the level of the kinase MSK1 implying that through it, they mutually regulate some of the physiological responses of cells under alkaline conditions. Finally, it seems that all these reactions contribute to H9c2 cell survival since inhibition of all three MAPKs studied increases massively the number of dead cells.

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση των επιπτώσεων των μεταβολών του εξωκυτταρικού pH και συνθηκών που σχετίζονται με μεταβολές του ενδοκυτταρικού pH, όπως είναι η επίδραση αυξητικών παραγόντων και οξειδωτικού στρες, στην ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών των MAPKs σε πειραματικά μοντέλα καρδιακών κυττάρων. Τα βιολογικά υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η απομονωμένη εμποτισμένη καρδιά του αμφιβίου Rana ridibunda, οι H9c2 καρδιακοί μυοβλάστες αρουραίου και τα απομονωμένα καρδιακά κοιλιακά μυοκύτταρα νεογνού αρουραίου. Για τους σκοπούς της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν βιοχημικές, ανοσολογικές, ιστοχημικές, μοριακές και ραδιοχημικές μέθοδοι. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αλκάλωση, η οξέωση και το σύστημα της ξανθίνης/οξειδάσης της ξανθίνης ενεργοποιούν την p38-ΜΑΡΚ στην καρδιά του αμφιβίου, το τελευταίο μέσω της παραγωγής του ανιόντος του υπεροξειδίου. Η επαγόμενη από την αλκάλωση ενεργοποίηση της p38-ΜΑΡΚ εξαρτάται από τη λειτουργία του ΝΗΕ1 και της Νa⁺/Κ⁺-ΑΤΡάσης, ενώ τόσο αυτό το ερέθισμα όσο και το σύστημα της ξανθίνης/οξειδάσης της ξανθίνης αυξάνουν τα επίπεδα φωσφορυλίωσης δύο πρωτεϊνών που βρίσκονται καταρροϊκά της p38-ΜΑΡΚ, της ΜΑΡΚΑΡΚ2 και της HSP27. Από πειράματα στα H9c2 κύτταρα βρέθηκε ότι η εξωκυτταρική αλκάλωση προκαλεί αύξηση του ενδοκυτταρικού pH και αυτό εξαρτάται τόσο από τον ΝΗΕ1 όσο και από τις ERKs. Η επώαση των κυττάρων με μέσο τιμής pH 8,5 ενεργοποιεί την p38-ΜΑΡΚ, τις JNKs και τις ERKs και, όπως στην περίπτωση του αμφιβίου, έτσι και στα H9c2 κύτταρα αυτό εξαρτάται από τον ΝΗΕ1. Ενεργοποίηση των ERKs αλλά και της κινάσης ΡΚΒ παρατηρείται επίσης και σε απομονωμένα καρδιακά κοιλιακά μυοκύτταρα νεογνού αρουραίου κατά την επίδραση αυξητικών παραγόντων και πεπτιδικών ορμονών. Στα H9c2 κύτταρα, και σε συνθήκες αλκάλωσης (pH 8,5), οι JNKs φωσφορυλιώνουν την υπομονάδα του μεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1 c-Jun και την αντιαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2, γεγονός που υποδεικνύει ότι οι κινάσες αυτές ελέγχουν τη γονιδιακή έκφραση και την επιβίωση των κυττάρων. Από την άλλη πλευρά, οι ERKs και η p38-ΜΑΡΚ συγκλίνουν στο επίπεδο της κινάσης MSK-1 υποδεικνύοντας ότι μέσω αυτής πιθανώς ρυθμίζουν από κοινού κάποιες από τις φυσιολογικές αποκρίσεις των κυττάρων σε αυτές τις συνθήκες. Τελικά, όλες αυτές οι αντιδράσεις φαίνεται ότι συμβάλλουν στην επιβίωση των H9c2 κυττάρων σε συνθήκες αλκάλωσης αφού η αναστολή και των τριών MAPKs που εξετάστηκαν αυξάνει μαζικά τον αριθμό των νεκρών κυττάρων.