Ρόλος μιτοχονδιακών πρωτεϊνών στην παθοφυσιολογία και θεραπευτική εκφυλιστικών παθήσεων

Abstract

One of the most frequent causes of mitochondrial disorders is cytochrome c oxidase (COX) deficiency. COX (complex IV in mitochondrial electron chain reaction) consists of thirteen (13) subunits that are organized as holoenzyme located within the inner mitochondrial membrane. One of the proteins involved in COX assembly is Sco2, encoded by nuclear SCO2 gene and then transported into the mitochondria, where contributes to COX assembly. Impaired COX assembly leads to COX deficiency, lack of cell respiration and cell death. This is quite critical in ageing and degenerative disorders. Mutations in SCO2 gene have been detected in newborns suffering of lethal encephalopathy characterized by COX deficiency, muscular weakness and hypertrophic cardiomyopathy (Papadopoulou et al., 1999). The present thesis work has been designed to: a) investigate the effects of two pathogenic point mutations (E140K, S225F), found in the human SCO2 gene, on the physical state of mitochondrial Sco2 protein and its copper binding capacity, and b) apply the Protein Transduction technology (PTD) to transduce wild type recombinant Sco2 protein into mitochondria of cultured glioma U-87 MG cells. Within the scope of present thesis, the point mutations (E140K, S225F) of SCO2 gene were studied. Wild type and mutants of SCO2 gene were cloned and expressed as heterologous proteins in E. coli cells, using fusion cloning and expression vector system (IMPACTTM-CN, pTYB11). Wild type and mutated forms of Sco2 were prepared as recombinant proteins and examined for their physical state, conformation and their ability to bind cooper. SDS-PAGE electrophoresis analysis revealed that Sco2E140K και Sco2S225F mutant forms of Sco2 protein are quite different from their wild type counterpart in physical state and copper capacity. Circular dichroism (CD) spectroscopy and thermal denaturation studies confirmed differences, supporting the motion that the two point mutations alter both the physical state and the binding capacity of Sco2 proteins (Foltopoulou et al., 2004). Combinatorial Cloning Technology complemented by the novel Protein Transduction Technology (PTD) was applied in order to attempt targeted intracellular delivery of human recombinant Sco2 protein in eukaryotic cells. Wild type recombinant Sco2 fusion protein, bearing also the TAT domain as PTD, His-tag and HA-tag, produced in genetically modified E. coli cells (Foltopoulou et al., 2006). This hererologous protein was resolved, refolded and delivered in culture of U-87 MG glioma cells. Preliminary immunofluorescent data, followed by subcellular localization, SDS-PAGE electrophoresis and Western Blotting analysis revealed that recombinant Sco2 protein had been delivered into mitochondria of mammalian cells. These experiments may allow correction of the clinical phenotype of SCO2 mutations via protein therapy (PTD-Technology). Finally, these studies represent a suitable model system for intracellular delivery of biopharmaceutical proteins as a new therapeutic approach of genetic diseases.

Κεντρικοί στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: α) η μελέτη της επίδρασης των σημειακών μεταλλάξεων (E140K, S225F) στη λειτουργία και φυσιολογική συμπεριφορά της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης συγκρότησης Sco2, και β) η ανάπτυξη τεχνολογίας μεταφοράς της φυσιολογικής πρωτεΐνης Sco2 στα μιτοχόνδρια θηλαστικών κυττάρων. Ο βασικός ρόλος της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COX) στην παραγωγή της κυτταρικής ενέργειας αναμφίβολα προσδίδει στο ένζυμο αυτό μία θεμελιώδη σημασία για τους αερόβιους οργανισμούς. Η COX, το τέταρτο σύμπλοκο της αναπνευστικής αλυσίδας, είναι ένα ολοένζυμο που αποτελείται από 13 υπομονάδες και εντοπίζεται στην εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων. Η COX καταλύει τη μεταφορά των ηλεκτρονίων από το ανηγμένο κυτόχρωμα c προς το μοριακό οξυγόνο (Ο2), τον τελικό αποδέκτη ηλεκτρονίων. Μεταλλάξεις σε πυρηνικά γονίδια, που αποτελούν γονίδια συγκρότησης της COX, οδηγούν σε αδυναμία συγκρότησης του ολοενζύμου της COX, την κύρια αιτία εμφάνισης μιτοχονδριακών ασθενειών, με μειωμένη δραστικότητα της COX, στον άνθρωπο. Συγκεκριμένα, ασθενείς με μεταλλάξεις στο γονίδιο συγκρότησης SCO2, ένα από τα γονίδια συγκρότησης της COX, εμφανίζουν θανάσιμες βρεφικές διαταραχές που χαρακτηρίζονται από μειωμένη δραστικότητα της COX, συμπτώματα μυϊκής αδυναμίας, υπερτροφική καρδιομυοπάθεια και εγκεφαλοπάθεια (Papadopoulou et al., 1999). Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, έγινε η ετερόλογη παραγωγή στην E. coli της ώριμης αγρίου τύπου πρωτεΐνης Sco2w/t (42-266aa), καθώς και των δύο μεταλλαγμένων μορφών της Sco2 πρωτεΐνης (Sco2E140K και Sco2S225F), ως χιμαιρικά μόρια με την ιντεΐνη, με τη χρήση του πλασμιδιακού φορέα pTYB11, και κατέστη δυνατός ο καθαρισμός τους μέσω χρωματογραφίας αγχιστείας. Παρατηρήθηκε ότι οι ανασυνδυασμένες διαλυτές πρωτεΐνες Sco2w/t και Sco2S225F, μετά την έκλουσή τους από το χρωματογραφικό υλικό, εμφανίστηκαν στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου στη μονομερή τους μορφή, ενώ η πρωτεΐνη Sco2E140K ανιχνεύθηκε κυρίως ως ζώνη μεγαλύτερης μοριακής μάζας, που πιθανόν αντιπροσωπεύει τη διμερή μορφή της πρωτεΐνης Sco2E140K. Η ανάλυση του φάσματος κυκλικού διχρωισμού και της θερμικής αποδιάταξης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Sco2w/t παρουσίασε ένα χαρακτηριστικό προφίλ φυσιολογικής αναδιπλωμένης πρωτεΐνης, με μεγάλο ποσοστό διαμόρφωσης α-έλικας. Από την άλλη, τα φάσματα των δύο ανασυνδυασμένων μεταλλαγμένων πρωτεϊνών, Sco2E140K και Sco2S225F, εμφάνισαν ουσιώδεις αλλαγές σε σχέση με το αντίστοιχο φάσμα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Sco2w/t. Οι διαφορές, που παρατηρήθηκαν, προτείνουν απώλεια σε κάποιο βαθμό της διαμόρφωσης της α-έλικας των μεταλλαγμένων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών (Sco2E140K και Sco2S225F), πιθανόν λόγω της μη σωστής αναδίπλωσης αυτών των πρωτεϊνών. Εκτίμηση της ικανότητας σύνδεσης των ανασυνδυασμένων Sco2 πρωτεϊνών με το χαλκό οδήγησε στο συμπέρασμα ότι οι δύο ανασυνδυασμένες μεταλλαγμένες Sco2 πρωτεΐνες (Sco2E140K και Sco2S225F) έχουν διαφορετική ικανότητα σύνδεσης με το χαλκό (Foltopoulou et al., 2004). Στην προσπάθεια ενδοκυτταρικής μεταγωγής της ανασυνδυασμένης αγρίου τύπου L-Sco2w/t πρωτεΐνης (πλήρους μεγέθους, 266aa) και ακόλουθης μεταφοράς στα μιτοχόνδρια, χρησιμοποιήθηκε η νέα τεχνολογία μεταγωγής πρωτεϊνών μέσω των PTDs (Protein Transduction Domains). Η αγρίου τύπου πρωτεΐνη L-Sco2w/t (266aa), εκφράστηκε ως χιμαιρικό μόριo είτε με την ιντεΐνη (ιντεΐνη-ΤΑΤ-L-Sco2-HA) είτε με την αλληλουχία δέκα (10) ιστιδινών (10xHis-XaSITE-TAT-L-Sco2-HA) μαζί με τις αλληλουχίες του TAT-PTD και του HA, με τη χρήση των πλασμιδιακών φορέων pTYB11 και pET-16b, αντίστοιχα (Foltopoulou et al., 2006). Η παραλαβή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε διαλυτή μορφή κατέστη εφικτή μετά από διαλυτοποίηση των βακτηριακών εγκλείστων, εμπλουτισμένων στην πρωτεΐνη 10xHis-XaSITE-TAT-L-Sco2-HA, σε διάλυμα L-αργινίνης 1Μ. Μεταγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε κύτταρα γλοιώματος (κυτταρική σειρά U-87 MG) και μελέτη με πειράματα, τόσο υποκυτταρικής κατανομής όσο και με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, έδωσαν τις πρώτες ενδείξεις για εντόπιση της ανασυνδυασμένης αυτής πρωτεΐνης στα μιτοχόνδρια των ευκαρυωτικών κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσματα ανοίγουν νέες προοπτικές για τη θεραπευτική προσέγγιση του φαινοτύπου της βρεφικής θανάσιμης καρδιοεγκεφαλομυοπάθειας, που οφείλεται σε μεταλλάξεις του SCO2 γονιδίου.