Μελέτη της δράσης αδρενεργικών και χολινεργικών παραγόντων (αγωνιστών - ανταγωνιστών) σε λευχαιμικά κύτταρα. Δοκιμασίες In vitro σε υγρές καλλιέργειες

Abstract

Based on the evident knowledge of autonomic innervation of the bone marrow, as well as the functional interaction between the immunological and autonomic nervous system, the aim of this study is to clarify the effect of neuropeptides and specifically to investigate the role of adrenergic and cholinergic factors (agonists, antagonists) on leukaemic cells. The material of the study consists of cells derived from 4 established leukaemic cell lines (aged 5-11 years) and blastic cells from the peripheral blood of patients with acute leukaemia (8 with AML and 3 with ALL). • Cell lines: Cell lines KG-91 [derived from AML-M3 t(15;17)] and KA-93 [from HCLv 14q+] express only erythroid markers (GlycA and γ-chains). The remaining two cell lines, ZA-93 [derived from AML-M1 t(8;21)] and MK-97 [from AML-M4Eο inv16] are EBV(+), express B lymphoid markers and excrete MIP1a, but differ regarding immunoglobulin expression (ZA-93: IgMK, MK-97: IgAK). • Acute leukaemia blast cells: AML (2 Ml, 2 M2, 2 M3v, 2 M4), ALL (1 B, 2 T). • Adrenergic factors: Methoxamine (α1-agonist), clonidine (α2-agonist), phentolamine (α-antagonist), isoproterenol (β-agonist), propranolol (β-antagonist), butoxamine (β2-antagonist), epinephrine (mixed α and β agonist). • Cholinergic factors: carbamylcholine (carbachol - agonist), atropine (antagonist). The liquid cellular cultures used, had a duration of 1-4 or occasionally more days. Cells with viability >80% and initial concentration of 0,1-0,5 X 106/ml were suspended in the medium (RPMI 1640 - Glutamax I with FBS 15%), with and without ("control cells") the addition of neuropeptide in final concentration of 1aM - 1mM, and were placed in the incubator. In regular intervals, samples were retrieved from the medium for cell counting, assessment of cell viability and cellular preparations in order to check their phenotype (immunophonotype with APAAP) and to detect apoptosis (in situ TUNEL-test). The results have shown that adrenergic factors exercise certain effects on the leukaemic cells, namely: A. Adrenergic factors. • α-Adrenergic factors: The agonists methoxamine and clonidine were tested in all 4 cell lines and were found to exercise statistically significant cytostatic effect at concentrations of 1mM (and occasionally 100μΜ). The inhibition of cell growth is obvious from the 2nd day. No apparent effects on the viability of the cells or apoptosis were observed. All cells retained their morphology. Immunophenotypically the expression of the erythroid markers GlycA and γ-chains was reduced in KG-91 and KA-93 cells. In ZA- 93 cells the expression of MIP1a and sΙgMΚ was significantly increased, while the relevant markers in MK-97 cells remained unchanged. The antagonist phentolamine exhibited also a cytostatic effect in KG-91 cells, but not in KA-93. The findings are in line with the results from published studies on normal precursor cells. • β-adrenergic factors: Cells from all 4 lines exhibited statistically significant inhibition of their growth after the 2nd day, in the presence of isoproterenol at concentration of 100μΜ and in some cases 10μΜ. Occasionally this is combined with reduction of their viability and rarely with apoptosis. Phenotypically, a small decrease in the expression of the erythroid markers in KG-91 and KA-93 cells, as well as B lymphoid markers in ZA-93 and MK-97 was observed. A significant reduction was noted in the secretion of MIP1a by cells of the ZA-93 line within 24h, at low concentrations of isoproterenol (100nΜ-10μΜ), where no changes of their growth or viability were observed. On the other hand, isoproterenol at the same concentration and for the same time period did not affect MK- 97 cells. Similar results, showing decrease in cell growth, were also observed on blast cells derived from 4 AMLs (1 M1, 2 M3v and 1 M4). The effects of isoproterenol described can be explained by its ß-adrenergic agonist action, resulting in an increase in intracellular cAMP, which arrests cell growth in G1 or G0/G1 phase of the cell cycle, and even leads in apoptosis. Concerning β-adrenergic antagonists, the effect of propranolol is similar to the action of agonists, inhibiting cell growth in KG-91 and KA-93 cell lines. In contrast, butoxamine has no effect on the above cells. • Mixed α and β agonists: Epinephrine, at concentrations of 100μΜ (or even 10μΜ in some cases) leads to decrease of cell growth and viability and induces apoptosis in all cell lines from the 1st day. ZA-93 cells exposed to small concentrations of epinephrine (100nM- 10μΜ) for 24h, exhibited decreased secretion of MIP1a (proportional to the one caused by isoproterenol), while their growth rate remained unchanged. On the other hand, for the same concentration of epinephrine, MK-97 cells exhibited a reduction in growth rate and viability, combined with apoptosis, but not with true decrease of MIP1a secretion. In blast cells of acute leukaemias, epinephrine, at the same concentrations (10-100pM), results in reduction of cell viability and expression of specific markers, as well as apoptosis in certain degree. The augmented cytostatic and apoptotic effects of epinephrine may be due to its combined α and β adrenergic agonist action. In conclusion, the effects of adrenergic agonists on the growth and the phenotype of leukaemic cells point out to a direct, non-toxic action, possibly via adrenergic receptors. Specifically, as far as cell growth is concerned: i. α-adrenergic factors exhibit a cytostatic effect, ii. β-adrenergic factors also exhibit cytostatic and potentially apoptotic action, and iii. mixed adrenergic factors act mainly by inducing cellular apoptosis. Differences concerning the susceptibility and responsiveness of leukaemic cell lines to adrenergic factors, especially those sharing the same phenotype, are obviously related to the different origin and nature of the cells. Similarly, the differences noted on blast cells of acute leukaemias should be attributed to their heterogeneity, and in some degree to the purity of the blast population. B. Cholinergic factors. In contrast to adrenergic, cholinergic factors at concentrations 1aM-1mM that have been tested on the cells of the 4 cell lines had no effect on the growth or phenotype of the cells. Although the results of the present study offer certain suggestions for the functional role of the factors studied, further scientific research is required.

Με βάση τη βεβαιωμένη πλέον νεύρωση του μυελού των οστών από το αυτόνομο νευρικό σύστημα και τη λειτουργική σχέση ανοσολογικού και αυτόνομου νευρικού συστήματος, επιχειρείται με αυτή την εργασία μελέτη της επίδρασης νευροπεπτιδίων, και συγκεκριμένα αδρενεργικών και χολινεργικών παραγόντων (αγωνιστών - ανταγωνιστών), επί λευχαιμικών κυττάρων. Το υλικό της μελέτης αφορά κύτταρα από 4 καθιερωμένες λευχαιμικές σειρές (ηλικίας 5-11 ετών) και βλαστικά κύτταρα από το αίμα 11 ασθενών με οξεία λευχαιμία (8 με AML και 3 με ALL). • Κυτταρικές σειρές: Οι σειρές ΚΓ-91 [ανάπτυξη από AML-M3 t(15;17)] και ΚΑ-93 [ανάπτυξη από HCLv 14q+] εκφράζουν μόνο ερυθροειδείς δείκτες (GlycA και γ- αλύσους). Οι άλλες δύο σειρές, η ΖΑ-93 [ανάπτυξη από AML-M1 t(8;21)] και η ΜΚ-97 [ανάπτυξη από AML-M4Eo inv16] είναι EBV(+), εκφράζουν δείκτες Β λεμφοκυττάρου, εκκρίνουν MIP1a και διαφέρουν στις ανοσοσφαιρίνες (ΖΑ-93: IgMK, ΜΚ-97: IgAK). • Βλαστικά κύτταρα οξειών λευχαιμιών: AML (2 ΜΙ, 2 M2, 2 Μ3v, 2 Μ4), ALL (1 Β, 2 Τ). • Αδρενεργικοί παράγοντες: Μεθοξαμίνη (α1-αγωνιστής), κλονιδίνη (α2-αγωνιστής), φαιντολαμίνη (α-ανταγωνιστής), ισοπροτερενόλη (β-αγωνιστής), προπρανολόλη (β- ανταγωνιστής), βουτοξαμίνη (β2-ανταγωνιστής), επινεφρίνη (μικτός α και β αγωνιστής). • Χολινεργικοί παράγοντες: Καρβαμυλχολίνη (καρβαχόλη - αγωνιστής), ατροπίνη (ανταγωνιστής). Εφαρμόστηκαν υγρές κυτταρικές καλλιέργειες διάρκειας 1-4 ή και περισσότερων 24ώρων. Κύτταρα, με ζωτικότητα >80%, εναιωρούνται στο υγρό θρεπτικό μέσο (RPMI 1640 - Glutamax I με 15% FBS) με αρχική συγκέντρωση 0,1-0,5 X 106/ml, χωρίς την προσθήκη νευροπεπτιδίου (κύτταρα «μάρτυρες») και με προσθήκη νευροπεπτιδίου σε τελική συγκέντρωση 1aM - 1mM, και τοποθετούνται σε κλίβανο καλλιεργειών. Σε τακτά χρονικά διαστήματα λαμβάνεται καλλιεργητικό υλικό για αρίθμηση των κυττάρων, έλεγχο της ζωτικότητάς τους και ετοιμασία κυτταρικών παρασκευασμάτων για έλεγχο φαινοτύπου (ανοσοφαινότυπος με ΑΡΑΑΡ) και απόπτωσης (in situ TUNEL-test). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι αδρενεργικοί παράγοντες επιδρούν στα λευχαιμικά κύτταρα. Ειδικότερα, και συγκριτικά με τα κύτταρα «μάρτυρες», διαπιστώθηκαν τα εξής: Α. Αδρενεργικοί παράγοντες • α-Αδρενεργικοί παράγοντες: Οι αγωνιστές μεθοξαμίνη και κλονιδίνη δοκιμάστηκαν στα κύτταρα των 4 σειρών και διαπιστώθηκε ότι ασκούν στατιστικά σημαντική κυτταροστατική δράση σε συγκέντρωση 1mM (ή και 100μΜ περιστασιακά). Η μείωση της ανάπτυξης αρχίζει από το 2° 24ωρο, χωρίς επηρεασμό της ζωτικότητας ή απόπτωση των κυττάρων. Τα κύτταρα όλων των σειρών διατηρούν τη μορφολογία τους. Ανοσοφαινοτυπικά, στα κύτταρα ΚΓ-91 και ΚΑ-93 μειώνεται η έκφραση των ερυθροειδών δεικτών GlycA και γ-αλύσων. Στα κύτταρα ΖΑ-93 αυξάνεται σημαντικά η έκφραση της MIP1a και slgMK, ενώ οι αντίστοιχες εκφράσεις στα ΜΚ-97 δε μεταβάλλονται. Ο ανταγωνιστής φαιντολαμίνη ασκεί επίσης κυτταροστατική δράση στα κύτταρα ΚΓ-91, όχι όμως και στα ΚΑ-93. Τα ευρήματα παραλληλίζονται με εκείνα περιορισμένων μελετών σε φυσιολογικά προγονικά κύτταρα που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. • β-Αδρενεργικοί παράγοντες: Τα κύτταρα όλων των σειρών, παρουσία ισοπροτερενόλης σε συγκέντρωση 100μΜ (ή και 10μΜ σε ορισμένες περιπτώσεις) εμφανίζουν στατιστικά σημαντική μείωση της ανάπτυξης από το 2°- 3° 24ωρο, συνοδευόμενη ενίοτε από μείωση της ζωτικότητάς τους ή σπανιότερα και από απόπτωση. Φαινοτυπικά, σημειώνεται μικρού βαθμού μείωση των ερυθροειδών δεικτών στα κύτταρα ΚΓ-91 και ΚΑ-93 και των Β λεμφικών δεικτών στα ΖΑ-93 και ΜΚ-97. Ειδικότερα, στα κύτταρα ΖΑ-93 διαπιστώθηκε σημαντική μείωση της εκκρινόμενης MIP1a εντός 24 ωρών σε μικρές συγκεντρώσεις ισοπροτερενόλης (100nΜ - 10μΜ), χωρίς επηρεασμό της ανάπτυξης και της ζωτικότητάς των κυττάρων. Αντίθετα, στις ίδιες μικρές συγκεντρώσεις ισοπροτερενόλης και στον ίδιο χρόνο, τα κύτταρα ΜΚ-97 δεν επηρεάζονται. Ανάλογα αποτελέσματα, με μείωση της ανάπτυξης σε διάφορο βαθμό, διαπιστώνονται και στα βλαστικά κύτταρα από 4 οξείες λευχαιμίες (1 ΜΙ, 2 Μ3v και 1 Μ4). Η δράση της ισοπροτερενόλης ερμηνεύεται από την ιδιότητά της ως β-αδρενεργικού αγωνιστή να αυξάνει ενδοκυττάρια το cAMP, μέσω σύνδεσης με αντίστοιχους β-αδρενεργικούς υποδοχείς. Η αύξηση του cAMP είναι γνωστό ότι προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης στη φάση G1 ή G0/G1 του κυτταρικού κύκλου και είναι δυνατόν να οδηγήσει ακόμη και σε απόπτωση. Από τους ανταγωνιστές, η προπρανολόλη συμπεριφέρεται ως αγωνιστής, μειώνοντας την ανάπτυξη των κυττάρων ΚΓ-91 και ΚΑ-93, σε αντίθεση με τη βουτοξαμίνη, η οποία δεν ασκεί καμία επίδραση στα ίδια κύτταρα. • Μικτοί α και β αγωνιστές: Η επινεφρίνη, σε συγκεντρώσεις 100μΜ (ή και 10μΜ σε ορισμένες περιπτώσεις) επιφέρει στα κύτταρα και των 4 σειρών, από το 1° 24ωρο, μείωση της ανάπτυξης και της ζωτικότητάς τους και κατά κανόνα απόπτωση. Στα κύτταρα της σειράς ΖΑ-93, σε μικρές συγκεντρώσεις επινεφρίνης (100nΜ - 10μΜ), στο 1° 24ωρο, χωρίς επηρεασμό της ανάπτυξης, σημειώνεται μείωση της εκκρινόμενης MIP1a, ανάλογη με την προκαλούμενη από την ισοπροτερενόλη. Αντίστοιχα, στα κύτταρα ΜΚ-97 παρατηρείται μείωση της ανάπτυξης και της ζωτικότητας, με στοιχεία απόπτωσης των κυττάρων, χωρίς, όμως, πραγματική μείωση της εκκρινόμενης MIP1a. Στα βλαστικά κύτταρα των οξειών λευχαιμιών η επινεφρίνη, στις ίδιες συγκεντρώσεις (10-100μΜ), προκαλεί μείωση της έκφρασης των ειδικών δεικτών, της ζωτικότητας των κυττάρων και απόπτωση σε ποικίλο βαθμό. Η εντονότερη κυτταροστατική και αποπτωτική δράση της επινεφρίνης αποδίδεται στην αθροιστική δράση α και β αδρενεργικού αγωνιστή που διαθέτει. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα από τη δράση των αδρενεργικών ουσιών στην ανάπτυξη και το φαινότυπο των λευχαιμικών κυττάρων είναι ενδεικτικά ότι αυτή είναι μη τοξική και ασκείται άμεσα, πιθανώς μέσω αδρενεργικών υποδοχέων. Συγκεκριμένα, όσον αφορά την ανάπτυξη των κυττάρων: i. οι α-αδρενεργικοί παράγοντες ασκούν κυτταροστατική δράση, ii. οι β-αδρενεργικοί ασκούν επίσης κυτταροστατική και δυνητικά αποπτωτική δράση και iii. οι μικτοί αδρενεργικοί παράγοντες δρουν κυρίως επάγοντας τα κύτταρα σε απόπτωση. Οι διαφορές στην ευαισθησία και ανταπόκριση των κυττάρων των σειρών στους αδρενεργικούς παράγοντες, ιδιαίτερα μεταξύ αυτών με τον ίδιο φαινότυπο, προφανώς σχετίζονται με τη διαφορετική προέλευση και φύση των κυττάρων. Αντίστοιχα, οι σημειωθείσες διαφορές στα βλαστικά κύτταρα των οξειών λευχαιμιών θα πρέπει να αποδοθούν στην ετερογένειά τους και σε ένα βαθμό και στην καθαρότητα του βλαστικού πληθυσμού. Β. Χολινεργικοί παράγοντες Σε αντίθεση με τους αδρενεργικούς, οι χολινεργικοί παράγοντες που δοκιμάστηκαν στα κύτταρα και των 4 λευχαιμικών σειρών, σε συγκεντρώσεις 1aM - 1mM, δεν έδειξαν να ασκούν κάποια δράση στην ανάπτυξη ή το φαινότυπο των κυττάρων. Οπωσδήποτε τα ευρήματα της μελέτης αποτελούν ενδείξεις για δράση των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν και απαιτούν ειδικότερη έρευνα για επιβεβαίωση.