Αξιοποίηση αποβλήτων ελαιουργείου μέσω μικροβιακών ζυμώσεων

Abstract

The problems in olive oil three-phase system waste disposal have recently led recently to the application of a new methodology: the two-phase olive oil extraction system. This new technique results in the production of olive oil and a byproduct, which is the mixture of solid and liquid waste. The goal of this study was to use the byproduct of the two-phase olive oil extraction, the so-called “alpeorujo”, as a substrate for microbial growth and subsequently to result in a more friendly and useful byproduct released at the environment. Samples that were collected from a very well - known waste treatment company were chemically analysed. The phenol (2,7 %) as well as the sugar (2,3 %) content allow for the growth of various microorganisms on this waste. The microorganisms were isolated and identified according to classical microbiological methods in combination with molecular techniques. The results of this study have shown that the bacteria population is mainly characterised by Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas and Bacillus (10⁴ - 10⁷ cfu/g waste), while yeasts isolated belong to the genera Saccharomyces and Candida (10⁴ - 10⁶ cfu/g waste). Specific bacterial strains were isolated at 60°C (Aeromonas, Bacillus, Corynebacterium), while others (Lactobacillus, Bifidobacterium, Gemmela) grew under anaerobic conditions. Selected strains of bacteria and yeasts were used as inocula in microcosm systems experiments using apeorujo as a substrate. Bacteria were unable to grow under the specific microcosm system conditions, but there was a 4-fold increase in yeast population. The results of the chemical analysis showed a significant reduction in the phenolic content leading in a less toxic byproduct released to the environment. From all the strains that have been isolated from alpeorujo, the strain that has been selected for further study was Paecilomyces variotii, not only because it has been proven capable of increasing the protein content in some preliminary experiments, but also because it has had already been reported in the past for its excellent ability to grow in a variety of highly-polluted industrial effluents, such as molasses, wood hydrolysates and spent sulfite liquor. The physiological studies of the specific fungus is the first necessary step for the optimisation of the fermentation parameters. In order to study the growth and the metabolic activity of the microorganism, the solid state system that has been developed in our lab (Microbiology lab., University of Athens) was connected to a Gas analyser to have the possibility of continuous analysis of gaseous effluent. Thus the CO₂ production and the O₂ consumption were on-line measured. The solid state fermentor is designed to allow temperature regulation by submersion of the column in a water bath, precise regulation of air flux. Two different kinds of alpeorujo wastes have been used as substrates in the solid state fermentation experiments: fresh alpeorujo (no further treatment) and dried (has been dried at high temperature) as well as two different temperatures (30°C and 35°C). First results have shown that both waste kinds can be used as substrates, while protein content was increased by 20% in the final product. Finally, when diluted sugar beet molasse was used as an enrichment factor, the production of microbial protein was higher and the protein content of the final product had been optimised by 46%. Because Paecilomyces variotii is a biotechnologically interesting strain and it has been used to detoxify various wastes (Romantschuk & Lehtomaki, 1978, Silva et al., 1995), it has been considered crucial to broaden its study on a molecular level. Firstly, through mutagenesis, a specific mutated strain has been selected, which can be used for further experiments. Besides this, two genomic libraries of the wild type have been constructed. In order to check if the two libraries are representative of the fungal genome, we made an effort to locate conservative genes, such as atcnA and argB in the two libraries. Mutated strains of A.nidulans lacking the specific genes have been transformed with the two genomic libraries in order to isolate strains that contain the two genes. Finally, the last step of this work comprises of the optimisation of the existing method for A.nidulans transformation. We systematically investigated the efficiency of A.nidulans transformation using protoplasts prepared from different stages of conidiospore germination and young mycelium. Using standard integrative plasmids, increased transformation yields were obtained with protoplasts isolated from a specific stage coincident with germ tube emergence. This increase ranged, on the average, from two- to eight-fold depending on the different plasmids used. Transformation efficiencies with a replicative plasmid were similar to those obtained using previously described methods. This method is significantly easier and faster than other current methods and it could offer a good alternative approach with strains where mycelium is either recalcitrant to protoplastation or protoplasts from mycelium are inefficiently transformed.

Τα προβλήματα διάθεσης των αποβλήτων του τριφασικού συστήματος οδήγησαν τα τελευταία χρόνια σε μια νέα μεθοδολογία παραγωγής ελαιόλαδου: το διφασικό σύστημα. Κατά τη χρησιμοποίηση της νέας αυτής τεχνολογίας παράγονται μόνο δύο φάσεις: το ελαιόλαδο και τα παραπροϊόντα, τα οποία είναι μίγμα του ελαιοπυρήνα και των υγρών αποβλήτων. Στο διδακτορικό αυτό έγινε προσπάθεια αξιοποίησης του αποβλήτου που προέρχεται από διφασικά συστήματα παραγωγής ελαιολάδου (ελαιόπουλπα) μέσω μικροβιακών ζυμώσεων. Από μεγάλη εταιρεία διαχείρισης αποβλήτων ελαιουργείου ελήφθησαν δείγματα αποβλήτου προερχόμενα από διαφορετικά στάδια της διαδικασίας παραγωγής ελαιολάδου, τα οποία αναλύθηκαν ως προς τη χημική τους σύσταση. Η σχετικά χαμηλή περιεκτικότητα ταννινών στο απόβλητο (2,7%) καθώς και η επαρκής ποσότητα σακχάρων (2,3%) επιτρέπουν την ανάπτυξη πληθώρας μικροοργανισμών. Στο συγκεκριμένο απόβλητο έγινε ταυτοποίηση του μικροβιακού πληθυσμού μέσω των κλασικών μεθόδων μικροβιολογίας. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι τα βακτήρια ανήκαν κυρίως στα γένη Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas και Bacillus σε σχετικά μεγάλους πληθυσμούς (10⁴ - 10⁷ cfu/g αποβλήτου), ενώ τα στελέχη των ζυμών στα γένη Saccharomyces και Candida τα οποία απαντούσαν σε μικρότερη συχνότητα (10⁴ - 10⁶ cfu/g αποβλήτου). Μελέτες φυσιολογίας στο εργαστήριο έδειξαν ότι μερικά από τα απομονωθέντα βακτηριακά στελέχη είχαν την ικανότητα ανάπτυξης σε υψηλές θερμοκρασίες, όπως εκείνη των 60°C (Aeromonas, Bacillus, Corynebacterium) καθώς και υπό αναερόβιες συνθήκες (Lactobacillus, Bifidobacterium, Gemmela). Επιλεγμένα στελέχη των απομονωθέντων βακτηρίων και ζυμών χρησιμοποιήθηκαν ως εμβόλια σε συστήματα μικρόκοσμου έχοντας ως υπόστρωμα απόβλητο ελαιόπουλπας. Ενώ τα βακτήρια αδυνατούσαν να αναπτυχθούν στις δοσμένες συνθήκες, ο πληθυσμός των ζυμών αυξήθηκε κατά 4 λογαριθμικές μονάδες με αποτέλεσμα την αλλαγή της χημικής σύστασης του αποβλήτου. Το προϊόν της ζύμωσης ήταν αρκετά πιο φιλικό προς το περιβάλλον σε σχέση με το αρχικό απόβλητο, τόσο λόγω της φρουτώδους οσμής, μετά το τέλος της ζύμωσης, όσο και της μείωσης της ποσότητας των φαινολών κατά 42 - 58%. Επειδή όμως δε σημειώθηκε αύξηση του πρωτεϊνικού περιεχομένου σ’ αυτή τη σειρά πειραμάτων, προχωρήσαμε στην αξιοποίηση του συγκεκριμένου αποβλήτου εμβολιάζοντας το απόβλητο ελαιόπουλπας με το ενδογενές μυκητιακό στέλεχος Paecilomyces variotii. Προηγήθηκε εκτενής μελέτη της μορφολογίας και της φυσιολογίας του στελέχους, για τον προσδιορισμό των καλύτερων συνθηκών ανάπτυξης του μικροοργανισμού. Για τη διεξαγωγή αυτών των πειραμάτων εγκαταστάθηκε στο εργαστήριο μικροβιολογίας σύστημα στερεού ζυμωτήρα. Το σύστημα αυτό αποτελείται από 16 κολώνες ζύμωσης και είναι σχεδιασμένο έτσι ώστε να επιτρέπει τη ρύθμιση της θερμοκρασίας με βύθιση της κολώνας σε υδατόλουτρο, την ακριβή ρύθμιση του αερισμού και τη δυνατότητα ελέγχου των αερίων που παράγονται κατά τη διάρκεια της ζύμωσης. Η εκτίμηση της μεταβολικής δραστηριότητας του μικροοργανισμού έγινε εκτιμώντας το παραγόμενο CO₂ με τη βοήθεια αέριου χρωματογράφου συνδεδεμένου με το στερεό ζυμωτήρα. Στα πειράματα στερεών ζυμώσεων χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα δύο είδη ελαιόπουλπας: νωπή (δεν έχει υποστεί καμία επεξεργασία) και ξηρή (έχει ξηραθεί προηγουμένως) καθώς και διαφορετικές θερμοκρασίες επώασης (30°C και 35°C). Τα πρώτα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο η νωπή όσο και η ξηρή ελαιόπουλπα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υποστρώματα και το τελικό ζυμωμένο προϊόν έχει αυξημένο πρωτεϊνικό περιεχόμενο κατά 20%. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε αραιωμένο διάλυμα μελάσσας ως παράγοντας εμπλουτισμού της ελαιόπουλπας βελτιστοποιώντας την παραγωγή μικροβιακής πρωτεΐνης και αυξάνοντας το πρωτεϊνικό περιεχόμενο του τελικού προϊόντος κατά 46%. Δεδομένων των παραπάνω αποτελεσμάτων και έχοντας υπόψη ότι ο Paecilomyces variotii είναι ένας ενδιαφέρον βιοτεχνολογικά μικροοργανισμός και στελέχη του έχουν χρησιμοποιηθεί για την αποτοξικοποίηση διαφόρων αποβλήτων (Romantschuk & Lehtomaki, 1978, Silva και συν., 1995) θεωρήθηκε σημαντική η περαιτέρω μελέτη του στελέχους σε μοριακό επίπεδο. Στην παρούσα διατριβή, έγινε προσπάθεια ανάπτυξης πρωτοκόλλων μοριακού χειρισμού του στελέχους Paecilomyces variotii που απομονώθηκε από απόβλητο ελαιουργείου. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν τα εξής βήματα: α) Μέσω της διαδικασίας της μεταλλαξογένεσης απομονώθηκε ένα μεταλλαγμένο στέλεχος με νέες ιδιότητες, του οποίου η μορφολογία και η φυσιολογία μελετήθηκαν εκτενώς και το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί μελλοντικά σε πειράματα μετασχηματισμού, β) Δημιουργήθηκαν 2 γονιδιωματικές βιβλιοθήκες του στελέχους Paecilomyces variotii. Προκειμένου να ελεγχθεί η πληρότητα των ανωτέρω γονιδιωματικών βιβλιοθηκών, δηλαδή αν περιείχαν όσο το δυνατό πιο αντιπροσωπευτικό δείγμα του γονιδιώματος του συγκεκριμένου στελέχους, εντοπίστηκαν συντηρημένα γονίδια και έγινε προσπάθεια εισαγωγής των αντίστοιχων γονιδίων argB και actin της γονιδιωματικής βιβλιοθήκης του Paecilomyces variotii σε άλλα μεταλλαγμένα στελέχη μυκήτων όπως του Aspergillus nidulans που παρουσιάζουν έλλειψη των φυσιολογικών γονιδίων. Στο πλαίσιο αυτό έγινε ένα τελευταίο βήμα που ήταν η βελτιστοποίηση της μεθόδου μετασχηματισμού πρωτοπλαστών με σκοπό τη δυνατότητα υποκλωνοποίησης γονιδίων. Η νέα μέθοδος αφορά την απομόνωση πρωτοπλαστών από σπόρια του μύκητα Aspergillus nidulans καθώς και πειράματα σύγκρισης της συγκεκριμένης μεθόδου με την ήδη υπάρχουσα, που αφορά απομόνωση πρωτοπλαστών από μυκήλιο του μύκητα. Είναι γνωστό ότι ο A. nidulans χρησιμοποιείται ως πρότυπο σύστημα για την ανάπτυξη ή βελτίωση πρωτοκόλλων μετασχηματισμού που θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε μύκητες που παρουσιάζουν βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον. Η βελτίωση των συχνοτήτων μετασχηματισμού μέσω της νέας μεθόδου δίνει τη δυνατότητα λήψης μετασχηματισμένων κυττάρων ακόμα και σε θεωρητικά δύσκολες περιπτώσεις, όπως εκείνες των μυκήτων των οποίων ο μετασχηματισμός είναι χαμηλής απόδοσης ή δεν έχει περιγράφει.