Μελέτη των μηχανισμών απόπτωσης του αμφιβληστροειδούς στην ενδοφθαλμίτιδα

Abstract

Infectious endophthalmitis is one of the most serious complications after intraocular surgery, constituting a therapeutic challenge. Staphylococcus epidermitis is the most common cause of acute postoperative endophthalmitis. The purpose of this study was to investigate the expression of inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, and IFN-γ in the vitreous and the potential involvement of the apoptosis and its regulators Bcl-2, Bax, and Fas within the retina in S. epidermidis experimental endophthalmitis. Endophthalmitis was induced in 48 male Lewis rats by unilateral 25-μL intravitreal injection of 7,000 viable organisms of slime-producing S. epidermitis strain ATCC 35983 (experimental group). Forty-eight rats received a similar sterile normal saline injection (control group). The injected eyes were graded for clinical inflammation and were removed in groups at 6, 12, 24, 48, 72, and 168 hours’ post-injection. Vitreous was obtained and titers of TNF-α, IL-1β, and IFN-γ were measured with established enzyme-linked immunosorbent assays. After surgical separation, retinal tissue specimens were fixed, and paraffin sections underwent hematoxylin-eosin staining, immunohistochemistry against Bcl-2, Bax, and Fas, and TUNEL assay for detection of apoptotic cells. Following morphometric analysis, the apoptotic body index (ABI) was calculated. In the experimental group, the clinical inflammatory score reached maximum within 24 h, while inflammation was almost abolished by day 7. Statistically increased levels of TNFα and IL-1β were detected in the experimental vitreous with maximum levels observed at 12 h. IFN-γ was also detected in the experimental vitreous and reached maximum levels at 48 h. While Bcl-2 expression was absent, Bax and Fas expression and apoptosis in ganglion cells, dipolar cells, and photoreceptors, were significantly higher in the experimental group compared to the control group (p<0.05). In the experimental group, inflammation peaked at 24 hours, Bax and Fas expression at 48 hours and the ABI at 72 hours’ post-injection. The results of this study suggest that S. epidermidis experimental endophthalmitis induces the expression of cytokines TNF-α, IL-1β and IFN-γ in the vitreous. The time course of those cytokine expression levels is closely associated to the clinical presentation of this endophthalmitis model. In addition, apoptosis is increased within the retina in S. epidermidis experimental endophthalmitis through upregulation of Bax and Fas, peaking soon after peak inflammation.

Η λοιμώδης ενδοφθαλμίτιδα αποτελεί μια πολύ σοβαρή επιπλοκή μετά από εγχείρηση καταρράκτη, που προβληματίζει ιδαίτερα ως προς τη θεραπευτική προσπέλαση. Ο S. epidermidis αποτελεί το συχνότερο υπεύθυνο μικροοργανισμό που απομονώνεται στις περιπτώσεις μετεγχειρητικής ενδοφθαλμίτιδας. Σκοπός της μελέτης είναι η διερεύνηση της έκφρασης των προφλεγμονωδών κυτταροκινών TNF-α, IL-1β και IFN-γ, καθώς και του ρόλου της απόπτωσης και των ρυθμιστών της Bcl-2, Bax και Fas σε πειραματική ενδοφθαλμίτιδα από S. epidermidis. Προκλήθηκε πειραματική ενδοφθαλμίτιδα στον ένα οφθαλμό σε 48 αρσενικούς αρουραίους Lewis με ενδοϋαλοειδική ένεση (25 μL) 7.000 ζώντων μικροοργανισμών S. epidermidis, στελέχους ATCC 35983 το οποίο παράγει εξωκυττάρια βλεννώδη στιβάδα (Slime) (πειραματική ομάδα). Στην ομάδα ελέγχου έγινε ενδοϋαλοειδική ένεση αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού. Οι οφθαλμοί σταδιοποιήθηκαν καθημερινά για σημεία κλινικής φλεγμονής και εξορύχθηκαν κατά ομάδες στις 6, 12, 24, 48, 72, και 168 ώρες μετά την ένεση. Έγινε λήψη του υαλοειδούς, στο οποίο μετρήθηκαν οι τίτλοι των κυτταροκινών TNF-α, IL-1β και IFN-γ με ELISA. Μετά από χειρουργική εξαίρεση, δείγματα αμφιβληστροειδικού ιστού σταθεροποιήθηκαν σε ουδέτερη φορμαλίνη 10% και τομές παραφίνης υποβλήθηκαν σε μέθοδο στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης για την ανίχνευση των Bcl-2, Bax και Fas, καθώς και σε in situ υβριδισμό (μέθοδος TUNEL) για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα της χρώσης εκφράστηκαν σε μορφομετρική ανάλυση και από την αναλογία αποπτωτικών σωμάτων υπολογίστηκε ο δείκτης απόπτωσης. Στην πειραματική ομάδα, η κλινική φλεγμονή ήταν μέγιστη 24 ώρες μετά την ένεση και σχεδόν εξαλείφθηκε έως την έβδομη μέρα. Αυξημένα επίπεδα TNF-α, IL-1β και IFN-γ μετρήθηκαν στο υαλοειδές της πειραματικής ομάδας, με μέγιστα επίπεδα στις 12 ώρες για τις TNF-α και IL-1β και στις 48 ώρες για την IFN-γ. Ο δείκτης απόπτωσης παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικά υψηλότερος στην πειραματική ομάδα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου σε όλους τους τύπους κυττάρων του αμφιβληστροειδούς. Η Bcl-2 δεν εκφράστηκε, ενώ η έκφραση των Bax και Fas εμφάνισε παρόμοια διακύμανση με αυτή του δείκτη απόπτωσης, συσχετιζόμενη θετικά με αυτόν. Η μελέτη αυτή καταδεικνύει ότι η πειραματική ενδοφθαλμίτιδα από S. epidermidis επάγει την έκφραση των κυτταροκινών TNF-α, IL-1β και IFN-γ στο υαλοειδές σε στενή χρονική συσχέτιση με το επίπεδο φλεγμονής. Δείχνει επίσης ενεργοποίηση της αποπτωτικής διαδικασίας μέσω των συστημάτων Bax και Fas, με μέγιστη έκφραση σε σύντομο χρονικό διάστημα μετά την κορύφωση της φλεγμονώδους διεργασίας.