Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων φασματομετρίας μάζας για τον προσδιορισμό πυρεθροειδών και νεονικοτινοειδών φυτοφαρμάκων σε δείγματα πειραματόζωων και εφαρμογή αυτών για την βιοπαρακολούθηση της έκθεσης σε αγροτικό και ειδικό πληθυσμό

Abstract

Aim of this study was to develop and validate new analytical methods for thedetection and quantification of parent and metabolite compounds of cypermethrinand imidacloprid pesticides in various biological samples. Also their toxicity wasinvestigated in-vivo. Pyrethroids and neonicotinoids are two classes of pesticideswidely and extensively used the last decades. The interest concerning thesesubstances is growing, since they are used as replacement for the organophosphorusand carbamates pesticides. Of a great concern is also the biomonitoring ofpopulation to these chemicals, especially for occupationally exposed individuals whoare exposed longer and in higher levels. Cretan population consists of a mixture ofrural and urban residents, while many individuals dealing with agricultural activitiesas amateurs. Furthermore, the residence of cretan population is offen nearagricultural facilities such as open fields and green houses. This results multiple riskand burden to the aforementioned pesticides. In literature even increasing reports ofacute or chronic toxicity cases of these substances can be found. The escalatingconcerns of the international scientific community on the effects of these substanceson populations, gave rise to this study.Cypermethrin is a synthetic pyrethroid pesticide used for both domestic andagricultural applications. Its chemical structure is relative to the natural pyrethrin. Itis supposed to be relatively low toxic for human and other mammals, while acts asneurotoxin when contact with insects. The specific metabolites for cypermethrin arecis- and irons-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylic acids (cisandtrans-Cl2CA) and the non-specific metabolite 3-phenoxybenzoic acid (3-PBA),which is common for at least ten different pyrethroids. Neonicotinoids are also agroup of synthetic pesticides with insecticidal act that found a lot of applicationmainly in agriculture, the last three decades. Imidacloprid is one of the mostcommon neonicotinoid, which is metabolized to the non-specific 6-chloronicotinicacid (6-ClNA). Although limited references can be found concerning neonicotinoids,it is proven that the toxicity of these pesticides must be examined. In-vivo experiments were executed on rabbits. Laboratory animals of samegender and age were used and were exposed orally with sub-acute dosages of theaforementioned pesticides. The administrated levels were calculated in order torepresent the 1/15 and 1/30 of the LD50 (lethal dose) when it was possible. Durationof the experiment was about 6 months. During experiment, samplings of biologicalsamples (urine, hair, blood) were executed (before beginning the administration andafter completing two months).Analytical methods for the detection of the parent compound and themetabolites were developed, using techniques of chromatography and massspectrometry. The developed methods were validated by calculating severalanalytical parameters (linearity, recovery, precision, accuracy, limits of detection-LOD, limits of quantification-LOQ). Furthermore, the results were compared withcontamination parameters (administrative dosage, duration of exposure).Briefly, for the detection of imidacloprid and its metabolite 6-ClNA, ananalytical method using liquid chromatography-mass spectrometry was developed.Limit of detection for imidacloprid was 0.02 ng/mg and 0.01 ng/mg for 6-ClNA in hairsamples, while in urine samples the corresponding values were 0.002 μg/ml forimidacloprid and 0.008 μg/ml for 6-ClNA. Satisfactory chromatographic separationwas achieved with retention time for imidacloprid 11.13 min and 12.46 min for 6-ClNA. Linearity of both standard solutions and spiked samples was more thansatisfactory for both hair and urine developed methods (>0.99). Mean recovery forimidacloprid was calculated to be 97.13% (n=9) and 91.42% (n=9) for 6-ClNA in hairsamples, while in urine samples the corresponding values were 96.11% (n=9) and103.44% (n=9). The method accuracy was >98.71% for imidacloprid and >100.25%for 6-ClNA in hair samples method and >98.93% for imidacloprid and >97.82% for 6-ClNA in urine samples method. The corresponding precision values were fluctuated<12.43%.Results of the analysis of in-vivo hair samples indicated statistically importantdifferences in the detected levels between the different treatment groups (control,low dose, high dose) for imidacloprid (P<0.001) but not for 6-ClNA (p=0.571). Found levels of imidacloprid in hair samples of control group were ranged from 0.62 to 1.61ng/mg, for low dose group from 0.99 to 41.91 ng/mg and for high dose from 0.26 to58.87 ng/mg. The corresponding concentrations of 6-ClNA in urine samples ofcontrol group were <LOD during the experiment, for low dose group found levelswere ranged from <LOD to 0.21 ng/mg and for high dose group from <LOD to 2.88ng/mg.Results regarding urine samples of exposed rabbits indicated statisticalimportant differences between the different treatment groups for both imidacloprid(p=0.008) and 6-ClNA (p=0.032). Levels of imidacloprid and 6-ClNA in urine samplesof control group were <LOD during the administration period. For low dose groupfound concentration of imidacloprid were ranged from <LOD to 125.02 μg/ml and forhigh dose group from <LOD to 343.17 μg/ml. Found values for 6-ClNA were from<LOD to 1.29 μg/ml and from <LOD to 4.25 μg/ml for low and high dose groups,respectively. Compared to 6-ClNA, the parent compound was indicated as moresuitable biomarker of exposure to the pesticide imidacloprid for both urine and hairsamples.Moreover, for the detection of the cypermethrin metabolites, cis-Cl2CA,trans-Cl2CA και 3-PBA, an analytical method using gas chromatography-massspectrometry (GC-MS) was validated and used. The limits of detection achieved forhair samples were 4.0 pg/mg for cis-Cl2CA, 3.9 pg/mg for trans-Cl2CA and 1.0 pg/mgfor 3-PBA, while for urine samples the corresponding limits were 1.4 ng/ml for cis-Cl2CA, 0.8 ng/ml for trans-Cl2CA and 0.3 ng/ml for 3-PBA. Linearity was good forstandard solutions and spiked samples in the investigated ranges (>0.99). Meanrecovery for cis-Cl2CA was 84.8% (n=8), for trans-Cl2CA 87.2% (n=8) and for 3-PBAwas 96.4% (n=8) for hair samples, while for urine samples the correspondingrecoveries were 102.1% (n=3), 111.2% (n=3) and 87.1% (n=3). Accuracy wasestimated to be >91.8% for cis-Cl2CA, >96.7% for trans-Cl2CA and >90.5% for 3-PBAfor hair samples method and >89.2% for cis-Cl2CA, >71.6% for trans-Cl2CA and>86.0% for 3-PBA for urine samples method. The corresponding precision valueswere fluctuated <13.6%. Results concerning hair samples of laboratory animals indicated statisticallysignificant differences between the different treatment groups (control, low dose,high dose) for cis-Cl2CA (p=0.009), trans-Cl2CA (p=0.003) and 3-PBA (p=0.012). Foundconcentrations of cis-Cl2CA in hair samples of control group were ranged from <LODto 112.6 pg/mg, for low dose group from <LOD to 1022.0 pg/mg and for high dosegroup from <LOD to 5361.4 pg/mg. The corresponding values for trans-Cl2CA in hairsamples of control group were from <LOD to 112.0 pg/mg, for low dose group from<LOD to 1367.0 pg/mg and for high dose group from <LOD to 5448.2 pg/mg. Finallyfor 3-PBA found levels were ranged from 16.5 to 42.8 pg/mg for control group, from<LOD to 146.7 pg/mg for low dose group and from <LOD to 659.9 pg/mg for highdose group.Levels of all cypermethrin metabolites in urine samples of control group were<LOD during the experiment. For low dose group levels of cis-Cl2CA were rangedfrom <LOD to 1365.6 ng/ml and for high dose group from <LOD to 5396.9 ng/ml. Thecorresponding values for trans-Cl2CA were from <LOD to 2311.4 ng/ml and from<LOD to 7453.9 ng/ml. Finally for 3-PBA found levels in urine samples of low dosegroup were ranged from <LOD to 813.1 ng/ml and for high dose group from <LOD to2072.8 ng/ml.Additionally, the influence of cypermethrin and imidacloprid in oxidativestress was investigated in-vivo by measuring TBARS, protein carbonyls, TAC levels inblood samples from exposed rabbits. Moreover the genotoxicity effects ofimidacloprid in the administrated dosages were examined in-vivo. Briefly, resultsindicated that cypermethrin does not affect any oxidative stress biomarker in theadministrated dosages. On the other hand, imidacloprid influences oxidative stress,since a significantly difference (p<0.05) in TBARS levels between exposed and controlgroups was observed. For the estimation of the genotoxic effects of the pesticideimidacloprid a Cytokinesis Block Micronuclei (CBMN) method was applied. Resultsindicated statistically significant differences between exposed and control group.The population study focused on different population groups in the widerregion of Cretem, which is a mixture of exposed (rural population, sprayers-applicators) and general population (without occupational exposure to pesticides).Hair samples were collected from each participant and filled alongside appropriatequestionnaire, which recorded basic socio-economic and clinical evidence, potentialexposure to pesticides, dietary habits, as well as chronic health problems. Head hairsamples were collected from the scalp, as close to the skin. In total, 58 hair sampleswere collected, of which 32 from residents of rural areas of Crete and 26 samplesfrom urban areas of Crete. Average age of participants of urban areas was 35 years,while 50% of the residents of the rural area were older than 50 years. 38.5% ofresidents of the urban area were males, while the rate for residents of the rural areawas 21.9%. The analysis was performed on all the available length of the hair inorder to study the burden of the studied substances over time. From the analysis ofthe samples observed detectable levels of imidacloprid only for residents of the ruralarea. However, no statistically significant difference was observed by examining thepopulation group by gender or age. The detection rate of imidacloprid for residentsof the rural area was quite high (65.6%), which is based on the questionnairesanswered can be attributed to the different lifestyle but also engage them withagricultural activities or the proximity of his residence in rural activities.The protocols developed in this thesis can be applied successfully to estimaterisk or biomonitoring in specific plant protection substances and their possibleassociation with health problems or other adverse side effects. Also these protocolscan be used to investigate incidents of acute poisoning in order to assess the clinicalpicture of the patient. In both cases, the importance of measurability of the abovesubstances in hair samples can be useful and provide important information for thepast and/or chronic exposure to these pesticides. Such an evaluation was not yetpossible due to the non-existence of those protocols sofar.

Στη συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαννέες αναλυτικές μέθοδοι με σκοπό τον προσδιορισμό των μεταβολιτών και τωνμητρικών ουσιών δύο νέων κατηγοριών φυτοφαρμάκων σε διάφορα βιολογικάδείγματα και μελετήθηκε in-vivo η τοξικότητά τους. Πιο συγκεκριμένα, επιλέχθηκαντα φυτοφαρμάκα cypermethrin και imidacloprid τα οποία αποτελούν δύο κύριεςαντιπροσωπευτικές χημικές δομές των πυρεθροειδών και νεονικοτινοειδών,αντίστοιχα. Οι αναλυτικοί μέθοδοι που αναπτύχθηκαν εφαρμόστηκαν τόσο σεδείγματα πειραματοζώων που ήταν επιβαρυμένα για μεγάλο χρονικό διάστημα σευποτοξικές δόσεις, όσο και για τη βιοπαρακολούθηση της έκθεσης σε αγροτικό καιμη πληθυσμό.Τα πυρεθροεϊδή και τα νεονικοτινοειδή είναι δύο ομάδες φυτοφαρμάκωνπου αποτελούν ίσως τις πλέον διαδεδομένες φυτοπροστατευτικές ομάδες ουσιώνμε ευρεία και εκτεταμένη χρήση τα τελευταία χρόνια. Το ενδιαφέρον για τιςσυγκεκριμένες ομάδες ολοένα και αυξάνεται εξαιτίας του γεγονότος ότι αποτελούντους αντικαταστάτες των έως πρότινος χρησιμοποιούμενων οργανοφωσφορικώνκαι καρβαμιδικών φυτοφαρμάκων στις καλλιέργειες. Ιδιαίτερο ενδιαφέροναποτελεί η διερεύνηση της επιβάρυνσης από τις νέες αυτές ομάδεςφυτοφαρμάκων, στο πληθυσμό της Κρήτης (μίγμα αστικού και αγροτικούπληθυσμού). Είναι πολύ μεγάλο το ποσοστό του πληθυσμού αυτού που ασχολείταιεπαγγελματικά αλλά και ερασιτεχνικά με καλλιέργειες. Επίσης, η πυκνότητα τωνκαλλιεργήσιμων περιοχών είναι αρκετά μεγάλη και συχνά εντοπίζονται δίπλα σεκατοικίες και οικισμούς, με συνέπεια την πολλαπλάσια επικινδυνότητα καιεπιβάρυνση σε φυτοπροστατευτικές ουσίες. Ολοένα αυξάνονται οι αναφορέςπεριστατικών οξείας ή χρόνιας τοξίκωσης από τις παραπάνω ομάδεςφυτοφαρμάκων στην διεθνή βιβλιογραφία και κλιμακώνεται η ανησυχία τηςδιεθνής επιστημονικής κοινότητας για τις επιδράσεις των ουσιών αυτών στην υγείατου πληθυσμού κάτι που αποτέλεσε εναύσματα για την παρούσα διατριβή. Το φυτοφάρμακο cypermethrin είναι ένα συνθετικό πυρεθροειδές πουχρησιμοποιείται ευρύτατα τόσο για οικιακή όσο και αγροτική χρήση. Η μοριακήδομή του είναι αντίστοιχη αυτής της φυσικής πυρεθρίνης. Πρόκειται για ουσίασχετικά χαμηλής τοξικότητας για ^ ν άνθρωπο, η οποία όμως είναι νευροτοξικήόταν έλθει σε επαφή με τα έντομα αναστέλλοντας τη δράση της αντλίας νατρίου-καλίου στην επιφάνεια των νευρικών κυττάρων. Γενικά, τα πυρεθροειδήμεταβολίζονται ταχύτατα στον οργανισμό και συνεπώς οι συγκεντρώσεις τους στηναιματική κυκλοφορία είναι πολύ μικρότερες από ότι των μεταβολιτών τους σταούρα. Οι ειδικοί μεταβολίτες για το cypermethrin είναι τα cis- και trans-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylic acids (cis- και trans-Cl2CA) καιο μη ειδικός μεταβολίτης 3-phenoxybenzoic acid (3-PBA), ο οποίος είναι κοινός γιατουλάχιστον δέκα διαφορετικά πυρεθροειδή.Τα νεονικοτινοειδή είναι επίσης μια ομάδα συνθετικών φυτοφαρμάκων μεεντομοκτόνο δράση και έχουν βρει εφαρμογή κυρίως στη γεωργία, τις τελευταίεςτρεις δεκαετίες. Κύριος αντιπρόσωπος των ουσιών αυτών είναι το imidacloprid, ομεταβολισμός του οποίου οδηγεί σε σχηματισμό του μη ειδικού μεταβολίτη 6-chloronicotinic acid (6-ClNA). Παρά την περιορισμένη βιβλιογραφική αναφορά σεπεριστατικά έκθεσης σε αυτές τις ουσίες, αποδεικνύεται ότι η τοξικότητα τωννεονικοτινοειδών είναι ένα ζήτημα που πρέπει να εξεταστεί.Πυρεθροειδή και νεονικοτινοειδή φυτοφάρμακα χρησιμοποιούνται σεμεγάλο ποσοστό σε θερμοκηπιακές καλλιέργειες (ντομάτα, αγγούρι, μαρούλι κτλ)αλλά και σε αυτές τις ελιάς και της αμπέλου. Καλλιέργειες που είναι ευρέωςαπαντούμενες στο νησί της Κρήτης. Εκτός από την χρήση αυτών των ουσιών γιααγροτικές δραστηριότητες σε ποσοστό 78%, ένα 10% των ουσιών βρίσκουνεφαρμογή για οικιακή χρήση. Η ευρεία χρήση των φυτοφαρμάκων σε συνδυασμόμε την πολλές φορές αλόγιστη και μη ακολουθούμενη τους κανονισμούς εφαρμογήτων ουσιών, προσθέτουν επιπλέον παράγοντες στην επιβάρυνση του ανθρώπινουοργανισμού από τα φυτοφάρμακα αυτά.Πραγματοποιήθηκαν in-vivo πειράματα μελέτης της υποτοξικής δράσης τωνεν λόγω φυτοφαρμάκων. Χρησιμοποιήθηκαν πειραματόζωα (κουνέλια) ίδιου φύλου και ίδιας ηλικίας. Μελετήθηκαν τα επίπεδα των παραπάνω φυτοφαρμάκων και τωναντίστοιχων μεταβολιτών τους σε βιολογικά δείγματα πειραματόζωων (τρίχες,ούρα, αίμα), τα οποία είχαν επιβαρυνθεί per os με συγκεκριμένες δοσολογίες. Οισυγκεντρώσεις αυτές υπολογίστηκαν έτσι ώστε να αντιπροσωπεύουν το 1/15 και1/30 της LD5o (lethal dose) όπου αυτή ήταν διαθέσιμη, για τις συγκεκριμένες ουσίεςγια χρονικό διάστημα περίπου 6 μηνών. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτωνσυλλέχθηκαν βιολογικά δείγματα (πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες στην αρχήτου πειράματος και στο τέλος κάθε διμήνου χορήγησης), ώστε να μελετηθεί, όσοναφορά τα δείγματα ούρων, ο μεταβολισμός των υπό ανίχνευση ουσιών, αλλά και ηπιθανή εναπόθεση τους στην τρίχα (μητρικής ουσίας και μεταβολιτών) για τονπροσδιορισμό της επιβάρυνσης του οργανισμού σε βάθος χρόνου.Αναπτύχθηκαν πρότυπες μέθοδοι ανάλυσης των μητρικών ουσιών(cypermethrin και imidacloprid) και των μεταβολιτών τους χρησιμοποιώνταςτεχνικές χρωματογραφίας συζευγμένες με φασματομετρία μάζας. Οι αναλυτικέςμέθοδοι αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν με τον υπολογισμό διάφορωναναλυτικών παραμέτρων (γραμμικότητα, ανάκτηση, ακρίβεια, ορθότητα, όριαανίχνεσης - LOD, όρια ποσοτικοποίησης - LOQ). Επιπλέον, τα αναλυτικάαποτελέσματα σχετίστηκαν με παραμέτρους που επηρεάζουν την εναπόθεση (π.χ.χορηγούμενη δόση, χρόνος έκθεσης).Συνοπτικά, για την ανίχνευση του φυτοφαρμάκου imidacloprid και τουμεταβολίτη του, 6-ClNA, αναπτύχθηκε μέθοδος ανίχνευσης με σύστημα υγρήςχρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (LC-MS). Τα όρια ανίχνευσης για ταδείγματα τριχών που αναλύθηκαν ήταν 0.02 ng/mg για το imidacloprid και 0.01ng/mg για το 6-ClNA, ενώ για τα δείγματα ούρων που αναλύθηκαν ήταν 0.002 μg/mlγια το imidacloprid και 0.008 μg/ml για το 6-ClNA. Ο χρόνος έκλουσης τουimidacloprid ήταν 11.13 min και 12.46 min για το 6-ClNA. Η γραμμικότητα τωνπρότυπων διαλυμάτων αλλά και των φορτισμένων δειγμάτων ήταν ικανοποιητικήτόσο για το πρωτόκολλο των δειγμάτων τρίχας όσο και για αυτό των ούρων (>0.99).Η μέση ανάκτηση για το imidacloprid ήταν 97.13% (n=9) και 91.42% (n=9) για το 6-ClNA για τα δείγματα τριχών, ενώ για τα δείγματα των ούρων οι αντίστοιχες ανακτήσεις ήταν 96.11% (n=9) και 103.44% (n=9). Η ακρίβεια της μεθόδου(accuracy) ήταν >98.71% για το imidacloprid και >100.25% για το 6-ClNA για τοπρωτόκολλο της τρίχας και >98.93% για το imidacloprid και >97.82% για το 6-ClNAγια το πρωτόκολλο των ούρων. Οι αντίστοιχες τιμές της ακρίβειας (precision)κυμαίνονταν <12.43% για όλες τις περιπτώσεις.Στα δείγματα τριχών των πειραματόζωων που αναλύθηκαν διαπιστώθηκανστατιστικά σημαντικές διαφορές στις ανιχνευόμενες συγκεντρώσεις ανάμεσα στιςομάδες των ζώων (control, χαμηλή δόση, υψηλή δόση) για το διάστημα 0 έως 6μηνών έκθεσης για το imidacloprid (p<0.001) αλλά όχι και για το 6-ClNA (p=0.571).Οι συγκεντρώσεις του imidacloprid στα δείγματα τριχών για την ομάδα ελέγχου(control) κυμαίνονταν από 0.62 έως 1.61 ng/mg, για την ομάδα της χαμηλής δόσηςαπό 0.99 έως 41.91 ng/mg και για την ομάδα της υψηλής δόσης από 0.26 έως 58.87ng/mg. Οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις του 6-ClNA στα δείγματα τριχών για τηνομάδα ελέγχου (control) ήταν <LOD σε όλη τη διάρκεια του πειράματος, για τηνομάδα της χαμηλής δόσης κυμαίνονταν από <LOD έως 0.21 ng/mg και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 2.88 ng/mg.Τα δείγματα ούρων των πειραματόζωων που αναλύθηκαν έδωσανστατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων έκθεσης για το διάστημα 0έως 6 μήνες έκθεσης τόσο για το imidacloprid (p=0.008), όσο και για το 6-ClNA(p=0.032). Οι συγκεντρώσεις του imidacloprid και του 6-ClNA στα δείγματα ούρωνγια την ομάδα ελέγχου (control) ήταν <LOD σε όλη τη διάρκεια του πειράματος. Γιατην ομάδα της χαμηλής δόσης οι συγκεντρώσεις του imidacloprid κυμαίνονταν από<LOD έως 125.02 μg/ml και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 343.17μg/ml. Οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις του 6-ClNA στα δείγματα τριχών για την ομάδατης χαμηλής δόσης κυμαίνονταν από <LOD έως 1.29 μg/ml και για την ομάδα τηςυψηλής δόσης από <LOD έως 4.25 μg/ml. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματαυπέδειξαν ως καταλληλότερο βιοδείκτη έκθεσης για το imidacloprid την ίδια τημητρική ουσία σε δείγματα τριχών συγκριτικά με τους μεταβολίτες της. Επιπλέον, ταδείγματα τριχών μπορούν να προσφέρουν μια σε βάθος χρόνου και ανάλογη τηςδόσης εικόνα επιβάρυνσης. Επιπλέον, για την ανίχνευση των μεταβολιτών του φυτοφαρμάκουcypermethrin, cis-Cl2CA, trans-Cl2CA και 3-PBA, αναπτύχθηκε μέθοδος ανίχνευσηςμε σύστημα αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GC-MS). Τα όριαανίχνευσης για τα δείγματα τριχών που αναλύθηκαν ήταν 4.0 pg/mg για το cis-Cl2CA, 3.9 pg/mg για το trans-Cl2CA και 1.0 pg/mg για το 3-PBA, ενώ για τα δείγματαούρων που αναλύθηκαν ήταν 1.4 ng/ml για το cis-Cl2CA, 0.8 ng/ml για το trans-Cl2CAκαι 0.3 ng/ml για το 3-PBA. Η γραμμικότητα των πρότυπων διαλυμάτων αλλά καιτων φορτισμένων δειγμάτων ήταν ικανοποιητική τόσο για το πρωτόκολλο τωνδειγμάτων τρίχας όσο και για αυτό των ούρων (>0.99). Η μέση ανάκτηση για το cis-Cl2CA ήταν 84.8% (n=8), για το trans-Cl2CA 87.2% (n=8) και για το 3-PBA ήταν 96.4%(n=8) για τα δείγματα τριχών, ενώ για τα δείγματα των ούρων οι αντίστοιχεςανακτήσεις ήταν 102.1% (n=3), 111.2% (n=3) και 87.1% (n=3). Η ακρίβεια τηςμεθόδου (accuracy) υπολογίστηκε >91.8% για το cis-Cl2CA, >96.7% για το trans-Cl2CAκαι >90.5% για το 3-PBA για το πρωτόκολλο της τρίχας και >89.2% για το cis-Cl2CA,>71.6% για το trans-Cl2CA και >86.0% για το 3-PBA για το πρωτόκολλο των ούρων.Οι αντίστοιχες τιμές της ακρίβειας (precision) κυμαίνονταν <13.6% για όλες τιςπεριπτώσεις.Τα δείγματα τριχών των πειραματόζωων που αναλύθηκαν έδωσανστατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες των ζώων (control, χαμηλήδόση, υψηλή δόση) για το διάστημα 0 έως 4 μήνες έκθεσης για όλους τουςμεταβολίτες, cis-Cl2CA (p=0.009), trans-Cl2CA (p=0.003), 3-PBA (p=0.012). Οισυγκεντρώσεις του cis-Cl2 CA στα δείγματα τριχών για την ομάδα ελέγχου (control)κυμαίνονταν από <LOD έως 112.6 pg/mg, για την ομάδα της χαμηλής δόσης από<LOD έως 1022.0 pg/mg και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 5361.4pg/mg. Οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις του trans-Cl2CA στα δείγματα τριχών για τηνομάδα ελέγχου (control) κυμαίνονταν από <LOD έως 112.0 pg/mg, για την ομάδατης χαμηλής δόσης από <LOD έως 1367.0 pg/mg και για την ομάδα της υψηλήςδόσης από <LOD έως 5448.2 pg/mg. Τέλος για το 3-PBA οι συγκεντρώσεις σταδείγματα τριχών για την ομάδα ελέγχου (control) κυμαίνονταν από 16.5 έως 42.8pg/mg, για την ομάδα της χαμηλής δόσης από <LOD έως 146.7 pg/mg και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 659.9 pg/mg. Τα αποτελέσματα πουπροέκυψαν από την ανάλυση των τριχών των πειραματόζωων έδειξαν αύξηση τωνεπιπέδων όλων των μεταβολιτών με τη πάροδο του χρόνου και η αύξηση αυτή ήτανανάλογη της χορηγούμενης δόσης.Οι συγκεντρώσεις όλων των μεταβολιτών στα δείγματα ούρων για τηνομάδα ελέγχου (control) ήταν <LOD για όλη τη διάρκεια του πειράματος. Για τηνομάδα της χαμηλής δόσης οι συγκεντρώσεις για το cis-Cl2CA από <LOD έως 1365.6ng/ml και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 5396.9 ng/ml. Οιαντίστοιχες συγκεντρώσεις του trans-Cl2 CA στα δείγματα τριχών για την ομάδα τηςχαμηλής δόσης κυμαίνονταν από <LOD έως 2311.4 ng/ml και για την ομάδα τηςυψηλής δόσης από <LOD έως 7453.9 ng/ml. Τέλος για το 3-PBA οι συγκεντρώσειςστα δείγματα τριχών για την ομάδα της χαμηλής δόσης κυμαίνονταν από <LOD έως813.1 ng/ml και για την ομάδα της υψηλής δόσης από <LOD έως 2072.8 ng/ml.Επιπλέον, μελετήθηκαν και για τα δύο φυτοφάρμακα οι δείκτες οξειδωτικούστρες (oxidative stress), (TBARS, protein carbonyls, TAC), αλλά και ο έλεγχος τηςγενοτοξικότητας αυτών. Συνοπτικά, από αυτές τις μελέτες προέκυψε ότι τοcypermethrin δεν επηρεάζει κάποιον από τους δείκτες του oxidative stress στιςχορηγούμενες δόσεις. Αντίθετα, το imidacloprid επηρεάζει το oxidative stress, αφούπαρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0.05) στα επίπεδα των TBARS καιγια τις δύο ομάδες χορήγησης. Επιπλέον για την αξιολόγηση της γενοτοξικήςδράσης των δύο υποτοξικών δόσεων χορήγησης, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδοςCytokinesis Block Micronuclei (CBMN). Έγινε καταμέτρηση των μικροπυρήνων μετάτην έκθεση των πειραματόζωων για παρατεταμένο χρονικό διάστημα, ωστόσο οιδιαφορές που παρατηρήθηκαν ήταν μόνο μεταξύ της ομάδας ελέγχου (control) καιτων εκτεθειμένων πειραματοζώων, χωρίς η διαφορά μεταξύ των δύο εκτεθειμένωνομάδων να είναι στατιστικά σημαντική (p>0.05).Η πληθυσμιακή μελέτη επικεντρώθηκε στην μελέτη επιβάρυνσης διάφορωνπληθυσμιακών ομάδων της ευρύτερης περιοχής της Κρήτης, οι οποίες είναι είτεεπιβαρυμένες από φυτοφάρμακα λόγω επαγγέλματος (αγροτικός πληθυσμός,ψεκαστές-εφαρμοστές κτλ), είτε γενικός πληθυσμός (χωρίς επαγγελματική έκθεση σε αυτά). Ο επαγγελματικά εκτεθειμένος πληθυσμός περιελάμβανε άτομαδιάφορων ηλικιών που κατοικούν σε αγροτικές περιοχές της Κρήτης και είτε έχουνάμεση ενασχόληση με αγροτικές καλλιέργειες είτε λόγω της παρακείμενηςδιαμονής τους σε αγροτικές δραστηριότητες (θερμοκήπια, ανοικτές καλλιέργειεςκτλ) ενδέχεται να έχουν παρατεταμένη και χρόνια έκθεση σε φυτοπροστατευτικέςουσίες. Ο μη επαγγελματικά εκτεθειμένος πληθυσμός περιελάμβανε άτομαδιαφόρων ηλικιών που κατοικούν σε αστικές περιοχές και δεν υπάρχει κάποιαγνωστή πηγή έκθεσης σε φυτοπροστατευτικές ουσίες. Συλλέχθηκαν δείγματατριχών από κάθε συμμετέχοντα στη μελέτη και παράλληλα συμπληρώθηκεκατάλληλο ερωτηματολόγιο, όπου καταγράφηκαν βασικά κοινωνικοοικονομικά καικλινικά στοιχεία, πιθανή έκθεση σε φυτοφάρμακα, διατροφικές συνήθειες, όπωςεπίσης χρόνια προβλήματα υγείας. Η δειγματοληψία τριχών, έγινε από το τριχωτότης κεφαλής, όσο το δυνατό κοντύτερα στο δέρμα, λίγο πίσω από την κορυφή τηςκεφαλής. Συνολικά συλλέχθηκαν 58 δείγματα τριχών, 32 από κατοίκους αγροτικώνπεριοχών της Κρήτης και 26 δείγματα από κάτοικους αστικής περιοχής της Κρήτης.Η μέση ηλικία των κατοίκων της αστικής ήταν τα 35 έτη, ενώ το 50% των κατοίκωντης αγροτικής περιοχής ήταν ηλικίας μεγαλύτερης των 50 ετών. Το 38.5% τωνκατοίκων της αστικής περιοχής ήταν άνδρες, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για τουςκατοίκους της αγροτικής περιοχής ήταν 21.9%. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σεόλο το διαθέσιμο της μήκος της τρίχας ώστε να μελετηθεί η επιβάρυνση από τιςμελετώμενες ουσίες σε βάθος χρόνου. Από την ανάλυση των δειγμάτωνπαρατηρήθηκαν ανιχνεύσιμα επίπεδα του imidacloprid μόνο για τους κατοίκους τηςαγροτικής περιοχής. Ωστόσο, καμία στατιστικά σημαντική διαφορά δενπαρατηρήθηκε εξετάζοντας την πληθυσμιακή ομάδα αυτή ανά φύλο ή ανά ηλικία.Το ποσοστό ανίχνευσης του imidacloprid για τους κατοίκους της αγροτικής περιοχήςήταν αρκετά υψηλό (65.6%), κάτι που βάση των ερωτηματολογίων πουαπαντήθηκαν μπορεί να αποδοθεί στον διαφορετικό τρόπο ζωής αλλά και τηνενασχόληση αυτών με αγροτικές δραστηριότητες ή και την εγγύτητα της κατοικίαςτου με αγροτικές δραστηριότητες. Τα πρωτόκολλα που αναπτύχθηκαν κατά τη παρούσα διδακτορική διατριβήμπορούν να εφαρμοστούν με επιτυχία με σκοπό την εκτίμηση κινδύνου ή τηνβιοπαρακολούθηση στις συγκεκριμένες φυτοπροστατευτικές ουσίες και την πιθανήσυσχέτιση με προβλήματα υγείας ή άλλες ανεπιθύμητες παρενέργειες. Επίσης ταπρωτόκολλα αυτά είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν για την διερεύνησηπεριστατικών οξείας δηλητηρίασης με σκοπό την εκτίμηση της κλινικής εικόνας τουασθενούς. Και στις δύο περιπτώσεις, η σπουδαιότητα της δυνατότητας μέτρησηςτων προαναφερθέντων ουσιών σε δείγματα τριχών μπορεί να αποβεί χρήσιμη καινα προσφέρει σπουδαίες πληροφορίες για την παρελθοντική ή/και χρόνια έκθεσηστα φυτοφάρμακα αυτά. Η δυνατότητα αυτή δεν ήταν μέχρι στιγμής εφικτή μιας καιδεν υπήρχαν ανάλογα πρωτόκολλα διαθέσιμα στη βιβλιογραφία.