Ταυτοποίηση του αντιγόνου 4C5 ως η πρωτεΐνη θερμικού σοκ HSP90. Μελέτη του μορίου στο νευρικό σύστημα και σε κύτταρα καρκίνου του μαστού

Abstract

The development of the vertebrate nervous system depends on extensive cell migration, which allows different cell types to reach their final destination and establish the composite organization of the adult nervous system. Cell migration is a complex process, which requires the coordination of many molecular and cellular events such as cell-cell recognition, adhesion, transmembrane signaling, and cell motility (131-135). The mechanisms underlying these processes involve orchestrated interactions between large numbers of molecules. In order to understand the molecular events regulating neuronal migration and development, we had previously characterized a monoclonal antibody (mAb), named 4C5, which was produced after immunization of mice with a brain membrane fraction of 15-day-old rat embryos. As shown by immunoblotting and immunocytochemistry, this antibody recognizes a 94 kDa cell surface peripheral antigen (4C5 antigen) in the developing rat nervous system (107). In the central nervous system, the 4C5 antigen is present in neurons. Moreover, antibody perturbation experiments, performed in cerebellar explant cultures using mAb 4C5, have indicated that the 4C5 antigen contributes to both the horizontal and the vertical neuron-neuron mediated migrations of granule cells during cerebellar development (108, 110). In the peripheral nervous system and in particular in the rat sciatic nerve, the presence of the 4C5 antigen was detected not only in neurons but also in myelin-forming and nonmyelin forming Schwann cells (109). Moreover, following adult sciatic nerve crush, the molecule was intensely re-expressed in Schwann cells of the distal segment, a few days after injury and during regeneration of the nerve. Antibody perturbation experiments performed in various in vitro systems of the peripheral nervous system using mAb 4C5 indicated that the 4C5 antigen participates in Schwann cell migration events during development and regeneration of the peripheral nervous system (111). Finally, data have been presented suggesting the involvement of this protein in actin cytoskeletal dynamics of migrating Schwann cells (111). The goals of the present work, was to investigate the identity of the 4C5 antigen and to further elucidate the molecular mechanisms underlying its action. In order to identify the 4C5 antigen we used a proteomic approach. In this context we performed MS analysis, which revealed that the 4C5 antigen is identical to the HSP90α protein, a member of the heat shock protein family. The identity of the 4C5 antigen was confirmed with immunoprecipitation experiments using mAb 4C5 and polyclonal anti-HSP90 antibodies.

Η ανάπτυξη του Νευρικού Συστήματος των θηλαστικών, εξαρτάται από εκτεταμένες κυτταρικές μεταναστεύσεις, οι οποίες επιτρέπουν σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους να φτάσουν στην τελική τους θέση και να συνθέσουν την πολύπλοκη οργάνωση του ενήλικου Νευρικού Συστήματος. Η κυτταρική μετανάστευση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, η οποία προϋποθέτει την ενορχήστρωση διάφορων μοριακών και κυτταρικών γεγονότων, όπως κυτταρική αναγνώριση, συγκόλληση, διαμεμβρανική μεταγωγή σήματος, και κυτταρική κίνηση (131-135). Οι μηχανισμοί οι οποίοι χαρακτηρίζουν όλες αυτές τις διαδικασίες, περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων, ένα δίκτυο αλληλεπιδράσεων μεγάλου αριθμού μορίων. Με σκοπό την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν τη μετανάστευση των νευρικών κυττάρων κατά την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος, πραγματοποιήθηκε στο παρελθόν η παραγωγή και ο χαρακτηρισμός ενός μονοκλωνικού αντισώματος, του mAb 4C5 (107). Το συγκεκριμένο αντίσωμα, αναγνωρίζει μία περιφερική πρωτεΐνη μοριακού βάρους 94 kDa (αντιγόνο 4C5). Το αντιγόνο 4C5 μελετήθηκε στο νευρικό σύστημα, και βρέθηκε ότι εντοπίζεται στους νευρώνες του ΚΝΣ, ενώ στο ΠΝΣ εντοπίζεται τόσο στους νευρώνες όσο και στα μυελινοποιητικά και μη μυελινοποιητικά κύτταρα Schwann (109). Επιπλέον, πειράματα λειτουργικής παρεμπόδισης με το mAb 4C5 σε ιστοκαλλιέργειες παρεγκεφαλίδας και ισχιακού νεύρου, έδειξαν ότι το συγκεκριμένο μόριο συμμετέχει τόσο στην οριζόντια όσο και στην κάθετη μετανάστευση των κοκκιωδών νευρώνων κατά την ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας (108, 110) καθώς και στη μετανάστευση των Schwann κυττάρων κατά την ανάπτυξη και αναγέννηση του ισχιακού νεύρου μετά από τραυματισμό, αντίστοιχα (111). Τέλος, προκαταρκτικά δεδομένα εισηγούνταν την πιθανή συμμετοχή του συγκεκριμένου μορίου σε διαδικασίες αναδιάταξης του κυτταροσκελετού (111). Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν ο προσδιορισμός της αμινοξικής αλληλουχίας του αντιγόνου 4C5 και η περαιτέρω διερεύνηση της λειτουργίας του. Προκειμένου να ταυτοποιηθεί το αντιγόνο 4C5, πραγματοποιήθηκε φασματοσκοπία μάζας και σύγκριση της αμινοξικής αλληλουχίας του μορίου με βάσεις δεδομένων γνωστών πρωτεΐνών, η οποία αποκάλυψε ότι το αντιγόνο 4C5 είναι ταυτόσημο με την πρωτεΐνη θερμικού σοκ HSP90α. Η ταυτότητα του αντιγόνου 4C5 επιβεβαιώθηκε με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρησιμοποιώντας το mAb 4C5 και δύο πολυκλωνικά αντισώματα έναντι των δύο ισομορφών της HSP90 (HSP90α και HSP90β). Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι το mAb 4C5 αντιδρούσε έντονα με την α ισομορφή της HSP90 και σε μικρότερο βαθμό με τη β ισομορφή.