Μελέτη του ρόλου της πρωτείνης BM88 στον καθορισμό της νευρωνικής ταυτότητας των κυττάρων

Abstract

BM88 is a neuron-specific protein widely expressed in the cells of the mammalian central and peripheral nervous system. Its biochemical characterization revealed that it is an integral membrane protein, located at the membranes of intracellular organelles (mitochondria, endoplasmic reticulum) with the bulk of the protein facing towards the cytoplasm. In the adult central nervous system BM88 is expressed in neurons but it is not detected in glial cells. During development, BM88 is initially expressed at the onset of neurogenesis in the rat brain, its levels rise with age and remain high in the adult. In vitro functional studies of BM88 over-expression in neuroblastoma cells suggest that BM88 is implicated in cell cycle exit and the initiation of differentiation towards a neuronal phenotype. These findings prompted us to study the expression of BM88 during neurogenesis and neuronal differentiation in vivo in order to investigate its role in brain development. For this reason, we have chosen as a model of study the developing rodent telencephalon. Initially, we investigated the distribution of BM88 protein in the developing cortex. To this end, we performed double-labeling experiments in sections from developing rat brain at embryonic days E14 and E18 using antibodies to BM88 and markers of the cell cycle such as cyclin D1 (G2/M phase marker) and bromo-2-deoxyuridine (BrdU), a thymidine analogue that is incorporated in DNA during its replication (S phase marker). The findings from these experiments revealed that BM88 protein is expressed in differentiated neurons, as well as in actively proliferating progenitor cells of the developing cortex of the rat and the mouse. We next sought to investigate whether BM88 is expressed during neurogenesis specifically in progenitor cells of the neuronal or glial lineage of telencephalon. To this end we performed double and triple-labeling experiments with antibodies to BM88 and to markers of the neuronal or glial lineages, in combination with markers of the cell cycle. We observed that BM88 protein is expressed exclusively in neuronal progenitors, but not in the proliferating or differentiated cells of the glial lineage. The above results were also supported by the fact that BM88 protein was detected in neuroepithelial “radial glial” cells that are which constitute the majority of neuronal progenitors in the cortex during embryonic days E14-E18. A subpopulation of these cells will turn into glial progenitors only after embryonic day E18 and during the early postnatal period. Moreover, we developed an experimental protocol that allowed us to mark a cohort of progenitor cells that exit the cell cycle in synchrony, using two different markers of the S phase of the cell cycle. Thus, we could observe in vivo, during a period of 12 to 24 hours, the migration and differentiation of a synchronized group of neural progenitor cells. The results from this experiment lead us to the conclusion that the expression of BM8 protein is associated with final asymmetric cell divisions that mark the onset of neurogenesis in the cortex and the generation of post-mitotic neurons. Thus, it appears that the expression of BM88 in neuronal progenitor cells drives them to exit from the cell cycle.

Η πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι νευροειδική πρωτεΐνη με ευρεία κατανομή σε κύτταρα του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος των θηλαστικών. O βιοχημικός χαρακτηρισμός του μορίου έδειξε ότι πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εντοπίζεται κυρίως στις μεμβράνες ενδοκυττάριων οργανιδίων (μιτοχόνδρια, ενδοπλασματικό δίκτυο) ενώ το μεγαλύτερο τμήμα του μορίου της προσανατολίζεται προς το κυτταρόπλασμα. Στο ενήλικο κεντρικό νευρικό σύστημα η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε νευρώνες ενώ δεν ανιχνεύεται σε γλοιοκύτταρα. Αναπτυξιακά, η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 ανιχνεύεται κατά την έναρξη της νευρογένεσης στον εγκέφαλο του αρουραίου ενώ τα επίπεδα της έκφρασή της αυξάνονται με την ηλικία και παραμένουν υψηλά στο ενήλικο ζώο. Λειτουργικά πειράματα in vitro υπερέκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 συσχετίζουν τη δράση του μορίου με την έξοδο των κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο και την έναρξη της διαδικασίας διαφοροποίησής τους προς νευρωνικό φαινότυπο. Τα παραπάνω δεδομένα μας ώθησαν να μελετήσουμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά τη διαδικασία της νευρογένεσης και της διαφοροποίησης των νευρώνων in vivo, έτσι ώστε να διερευνήσουμε το ρόλο της κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό επιλέξαμε ως σύστημα μελέτης τον αναπτυσσόμενο φλοιό του τελεγκεφάλου των τρωκτικών. Αρχικά χαρτογραφήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στο φλοιό του αναπτυσσόμενου τελεγκεφάλου κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14-Ε18 και πραγματοποιήθηκαν πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 καθώς και μαρτύρων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού όπως είναι η κυκλίνη D1 (μάρτυρας της φάσης G2/M του κυτταρικού κύκλου) και το ανάλογο της θυμιδίνης, βρωμο-2-δεοξυουριδίνη (BrdU), που ενσωματώνεται στο DNA κατά τη φάση της αντιγραφής του (φάση S του κυτταρικού κύκλου). Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται τόσο στους διαφοροποιημένους νευρώνες, όσο και σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα προγονικά κύτταρα στη κοιλιακή ζώνη του αναπτυσσόμενου φλοιού του αρουραίου και του ποντικού. Κατόπιν, διερευνήσαμε αν η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται κατά την περίοδο της νευρογένεσης ειδικά, σε προγονικά κύτταρα της γενεαλογίας των νευρώνων ή αν εκφράζεται και σε πρόδρομα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας του τελεγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν διπλές και τριπλές ανοσοϊστοχημικές χρώσεις με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 καθώς και έναντι νευρωνικών ή γλοιΐκών μαρτύρων, σε συνδυασμό με αντισώματα έναντι μαρτύρων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Παρατηρήθηκε ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται αποκλειστικά και μόνο σε κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας και όχι σε πολλαπλασιαζόμενα ή διαφοροποιημένα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν από το γεγονός ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 προσδιορίστηκε και σε νευροεπιθηλιακά κύτταρα του τύπου της «ακτινωτής γλοίας» που σύμφωνα με την τρέχουσα αντίληψη, αποτελούν την πλειοψηφία του πληθυσμού των πρόδρομων νευρογενετικών κυττάρων του φλοιού κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14-Ε18. Αργότερα μόνο, ένας υποπληθυσμός αυτών των κυττάρων αυτά θα αποτελέσει προδρόμους της γλοιϊκής γενεαλογίας, και συγκεκριμένα μετά τη 18η εμβρυϊκή ημέρα έως και τις πρώτες ημέρες μετά τη γέννηση.