Η πειραματική διερεύνηση της συμβολής της λεπτίνης στην νεοαγγειογένεση: πειραματική μελέτη

Abstract

Leptin, the product of the ob gene, is a non-glucosylated, 146 amino acid residue polypeptide that is produced and secreted by the adipocytes. Leptin plays a pivotal role in the regulation of body weight by controlling food intake, energy expenditure and sympathetic nervous system activity. Overwhelming evidence suggested a role for leptin as a multipotent cytokine implicated in the physiology of the digestive tract, reproductive function, haemopoesis, systemic neuroendocrine response and angiogenesis. Aim: The aim of this study was to investigate the angiogenic effect of leptin in vivo. Materials and methods: The disc angiogenesis system (DAS) was constructed as described previously and the disks were implanted subcutaneously in the back of 130 adult Wistar rats, in groups of 5 animals each. In the study group the disks contained as an angiogenic factor recombinant human leptin in concentrations of 25, 50, 100 and 250 ng/ml, respectively. In the negative control group leptin was replaced by normal saline. In order to study the specificity of the angiogenic effect of leptin, a specific anti-leptin antibody was used to inhibit the function of leptin with the implanted disks containing human recombinant leptin in concentrations of 25, 50, 100 and 250 ng/ml combined with 37.5, 75, 150 and 375 ng/ml of anti-leptin antibody, respectively. The discs were removed at 7 and 14 days after implantation, fixed in 10% formalin, embedded in paraffin and 5 μm thick planar sections were cut for immunohistochemistry and histological evaluation. Qualitative assessment of angiogenesis was performed on haematoxylin-eosin stained slides whereas quantitative assessment of angiogenesis was performed after immunohistochemical staining with an anti-CD34 antibody. Results: The number of new blood vessels in discs containing different leptin concentrations was significantly higher compared with control discs and increased proportionally with increasing concentrations of leptin and peaked at 100 ng/ml. This finding was observed at both time points (7 and 14 days after disc implantation). There was no significant difference between the leptin-induced number of blood vessels at 7 and 14 days for any concentration. Specific blocking of leptin abolished completely its angiogenic effect. The number of new blood vessels in discs containing different VEGF165 concentrations was significantly higher compared with control discs and increased proportionally with increasing concentrations of VEGF165 with a peak at 100 ng/ml. This finding was observed at both time points (7 and 14 days after disc implantation). The number of VEGF165-induced blood vessels at 14 days was significantly higher compared with the number of blood vessels at 7 days for all concentrations used. The leptin-induced number of new blood vessels at 7 days was significantly higher compared with the VEGF165-induced number of new blood vessels and was observed at all concentrations used. In contrast, there was no significant difference between leptin- and VEGF165-induced numbers of new blood vessels at the 14-day time point. Conclusions: It is concluded that leptin has an angiogenic effect in vivo. This effect is specific, dose- and time- dependent, and comparable with the angiogenic effect of VEGF165 but is evident earlier compared with the angiogenic effect of VEGF165.

Το παράγωγο του γονιδίου ob, η λεπτίνη, αποτελεί ένα μη γλυκοζυλιωμένο πολυπετίδιο 146 αμινοξέων που παράγεται και εκκρίνεται από το λιπώδη ιστό και διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στη ρύθμιση του σωματικού βάρους ελέγχοντας την πρόσληψη τροφής, την ομοιόσταση του ενεργειακού ισοζυγίου και τη δραστηριότητα του συμπαθητικού συστήματος. Νεότερες μελέτες έδειξαν ότι η λεπτίνη διαδραματίζει επίσης ρόλο στη φυσιολογία του πεπτικού, του αιμοποιητικού και του αναπαραγωγικού συστήματος, στην νευροενδοκρινική απάντηση του οργανισμού και στην αγγειογένεση. Έτσι, σήμερα η λεπτίνη θεωρείται σαν μία πολυδύναμη κυττοκίνη με πολλαπλές δράσεις και λειτουργίες στον ανθρώπινο οργανισμό. Σκοπός: Σκοπός αυτής της πειραματικής μελέτης ήταν η διερεύνηση της αγγειογενετικής δράσης της λεπτίνης in vivo. Υλικό και μέθοδοι: Το σύστημα μελέτης της αγγειογένεσης σε δίσκο (Disc Angiogenesis System, DAS) εμφυτεύθηκε στο υποδόριο της ραχιαίας επιφάνειες 130 επίμυων Wistar σε ομάδες των 5 πειραματοζώων η καθεμία. Στις ομάδες μελέτης, οι δίσκοι περιείχαν ανασυνδυασμένη ανθρώπεια λεπτίνη σε συγκεντρώσεις 25, 50, 100 και 250 ng/ml, αντίστοιχα, ενώ στις ομάδες αρνητικού ελέγχου η λεπτίνη αντικαταστάθηκε από φυσιολογικό ορό. Για τον έλεγχο της ειδικότητας της αγγειογενετικής δράσης της λεπτίνης, οι εμφυτευθέντες δίσκοι περιείχαν λεπτίνη και ειδικό αντίσωμα έναντι αυτής με συγκεντρώσεις λεπτίνης 25, 50, 100 και 250 ng/ml, και συγκεντρώσεις αντισώματος 37,5, 75, 150 και 375 ng/ml, αντίστοιχα. Στις ομάδες θετικού ελέγχου εμφυτεύθηκαν δίσκοι που περιείχαν ανασυνδυασμένο ανθρώπειο αυξητικό παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF165) σε συγκεντρώσεις 25, 50, 100 και 250 ng/ml. Τα πειραματόζωα θανατώθηκαν 7 και 14 ημέρες μετά την εμφύτευση των δίσκων, οι δίσκοι αφαιρέθηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα φορμαλδεΰδης 10%, σκηνώθηκαν σε παραφίνη και ελήφθησαν τομές για μικροσκοπική μορφολογική μελέτη σε χρώσεις αιματοξυλίνης-ηωσίνης και ποσοτικό προσδιορισμό των νεοσχηματισθέντων αγγείων σε ανοσοϊστοχημικές χρώσεις του αντιγόνου CD34 των ενδοθηλιακών κυττάρων