Κρυστάλλωση του υποδοχέα της HDL, SR-BI και ανάλυση της βιοχημικής του συμπεριφοράς in vitro

Abstract

Scavenger receptor class B type I (SR-BI) is the functional receptor for high density lipoprotein (HDL) and its three-dimensional structure has not been resolved. The main objective of my thesis was to produce sufficient quantities of homogeneously modified pure SR-BI suitable for crystallization studies. The long-term goal is to correlate the 3D structure with the known functions of SR-BI in the selective uptake of lipids and the efflux of free cholesterol. In order to produce large quantities of SR-BI with homogeneous modifications, the receptor was expressed in a mutant Human Embryonic Kidney (HEK) cell line, using a tetracycline-inducible system. The inducible expression of SR-BI in cell cultures in a bioreactor overcame the problem of cell aggregation and enhanced the protein yield. The mutant HEK cell line used for the expression of SR-BI was mutated in the N-acetyl Glucosaminyl Transferase I gene (GnTI). This mutation led to uniform glycosylation, with the high-mannose oligosaccharides GlcNAc(Man)5. The glycosylation properties of SR-BI were verified by Endoglycosidase H (EndoH) and N-Glycosidase F (PNGase F) digestions. PNGase F digests high mannose, as well as complex glycans. EndoH digests only high-mannose glycans. Western blotting analysis following these digestions verified the production of SR-BI with the expected degree of glycosylation (Μr ~54kDa). SR-BI produced on a small scale in cell cultures was purified by immunoaffinity chromatography from the cell lysates using Sepharose coupled to the monoclonal antibody 1D4. The antibody recognizes the epitope t1, a nonapeptide (TETSQVAPA) that corresponds to nine C-aminoacids of rhodopsin. The t1 epitope was engineered into the carboxy-terminus of SR-BI. Bound SR-BI was eluted by excess t1 and was detected by SDS-PAGE, Western blotting and silver staining. For large-scale spinner cultures the mutant HEK line (HEK293SGnTI-TetR) was grown in a CELLIGEN PLUS bioreactor, where the temperature and the pH value as well as the oxygen, nitrogen, carbon dioxide and air content of the culture were controlled electronically. The cell density achieved in this bioreactor was approximately 5 Χ 106 cells/ ml, total volume 5.5L). Using large-scale immunoffinity chromatography, 5-8 milligrams of pure protein were produced per 5.5 liters of culture. Part of the purified protein was incorporated into Ι-HDL and uptakes cholesteryl ether from [Η]-CE-HDL at levels similar to those of the wild type mSR-BI-t1. Increase in the concentration of CaClin the buffer leads to increased binding of HDL, but did not affect the uptake of cholesteryl ether. Binding of HDL and LDL is greatest at 37C, while uptake of their cholesteryl ether increased as temperature increased. Binding of HDL increased as pH decreased, without affecting the uptake of cholesteryl ether. Addition of sphingomyelin in the liposomes increased the uptake of cholesteryl ether from HDL, but did not affect the binding of liposomes composed of cholesterol and phosphatidylcholine (and in some cases, sphingomyelin) which were used for a filter binding assay. This assay allowed the calculation of the quantity of lipoproteins bound to the proteoliposomes and of the cholesteryl ether taken up by them via SR-BI. These analyses showed that the purified glycosylation mutant SR-BI-t1 is functional and that it binds 12532 o125I-HDL The chemical inhibitors BLT-1, 2, 3, 4 and 5 block the selective lipid uptake from HDL. These experiments revealed that the target of the BLTs is SR-BI itself. Substitution of the thiol group of BLT-1, which belongs to the thiosemicarbazone family of compounds, with an oxygen atom, created an inactive isoform of BLT-1. These studies also revealed the importance of the hydrophobic tail of BLT-1 for the inhibition of the SR-BI functions. A portion of the protein isolated by immunoaffinity chromatography underwent further purification by size exclusion and ion exchange chromatography, which showed that SR-BI preparations were homogeneously pure. The effect of pH, dithiothreitol (DTT), temperature and the age of the protein samples on their stability and oligomerization of SR-BI during the chromatography were also assessed. Crystallization of the purified SR-BI generated small hexagonal crystals 30-40 μm in length, which are being used currently in x-ray crystallographic studies for the elucidation of the atomic structure of SR-BI.

Ο SR-BI (Scavenger receptor class B type I) είναι ο λειτουργικός υποδοχέας των υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (High Density Lipoprotein, HDL), του οποίου η τρισδιάστατη δομή είναι άγνωστη. Βασικός στόχος της διατριβής μου ήταν η παραγωγή ικανής ποσότητας ομοιογενώς τροποποιημένης, καθαρής πρωτεΐνης SR-BI, κατάλληλης για μελέτες κρυστάλλωσης. Μακροπρόθεσμος στόχος είναι η συσχέτιση της τρισδιάστατης δομής του υποδοχέα, με τις γνωστές του λειτουργίες, όσον αφορά στην επιλεκτική πρόσληψη λιπιδίων και στην κυτταρική έξοδο ελεύθερης χοληστερόλης. Προκειμένου να παραχθούν μεγάλες ποσότητες SR-BI με ομοιογενή γλυκοζυλίωση, ο υποδοχέας εκφράστηκε σε μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά HEK (Human Embryonic Kidney), με χρήση ενός συστήματος επαγώμενης έκφρασης μέσω της προσθήκης τετρακυκλίνης. Η επαγώμενη έκφραση του SR-BI σε κυτταρικές καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα, παρέκαμψε το πρόβλημα της κυτταρικής συσσωμάτωσης και αύξησε την έκφραση της πρωτεΐνης. Η κυτταρική σειρά ΗΕΚ που χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση του SR-BI είναι μεταλλαγμένη ως προς το γονίδιο GnTI (N-acetyl Glucosaminyl Transferase I). Αυτή η μετάλλαξη οδήγησε σε ομοιόμορφη γλυκοζυλίωση του SR-BI με ολιγοσακχαρίτες υψηλής μανόζης GlcNAc(Man)5. Οι ιδιότητες γλυκοζυλίωσης του SR-BI πιστοποιήθηκαν μετά από πέψη με τα ένζυμα ενδογλυκοζιδάση Η (Endoglycosidase H, EndoH) και Ν-γλυκοζιδάση F (N-Glycosidase F, PNGase F). Η Ν-γλυκοζιδάση F πέπτει υψηλής μανόζης, καθώς και σύμπλοκες γλυκάνες. Η ενδογλυκοζιδάση Η πέπτει μόνο υψηλής μανόζης γλυκάνες. Ανάλυση κατά Western που ακολούθησε τις πέψεις επιβεβαίωσε την παραγωγή του SR-BI με τον αναμενόμενο βαθμό γλυκοζυλίωσης (μοριακή μάζα ~54kDa). Ο SR-BI που παρήχθη σε μικρή κλίμακα σε κυτταροκαλλιέργειες, απομονώθηκε με χρωματογραφία ανοσοσυγγενείας από το κυτταρικό εκχύλισμα, με χρήση σφαιριδίων σεφαρόζης συνεζευγμένων με το μονοκλωνικό αντίσωμα 1D4. Το αντίσωμα αυτό αναγνωρίζει τον επίτοπο t1, ένα εννεαπεπτίδιο (TETSQVAPA) που αντιστοιχεί στα εννέα καρβοξυτερματικά αμινοξέα της πρωτεΐνης ροδοψίνης. Ο επίτοπος t1 ενσωματώθηκε στο καρβοξυτερματικό άκρο εκλούσθηκε με προσθήκη περίσσειας πεπτιδίου t1 και ανιχνεύθηκε με SDS-PAGE, ανάλυση κατά Western και με χρώση αργύρου. Προκειμένου να πραγματοποιηθούν μεγάλης κλίμακας καλλιέργειες της μεταλλαγμένης κυτταρικής σειράς (HEK293SGnTI-TetR), χρησιμοποιήθηκε βιοαντιδραστήρας CELLIGEN PLUS, στον οποίον η θερμοκρασία, η τιμή του pH, καθώς και το περιεχόμενο της καλλιέργειας σε οξυγόνο, άζωτο, διοξείδιο του άνθρακος και αέρα, ελέγχεται ηλεκτρονικά. Η κυτταρική πυκνότητα που επετεύχθη στο βιοαντιδραστήρα ήταν περίπου 5 Χ 106 κύτταρα / ml (ολικός όγκος καλλιέργειας 5.5L). Χρησιμοποιώντας μεγάλης κλίμακας χρωματογραφία ανοσοσυγγενείας, παρήχθησαν περίπου 5-8 χιλιοστογραμμάρια καθαρής πρωτεΐνης ανά 5.5 λίτρα καλλιέργειας.