Δομικές μελέτες της πρωτείνης HrcQb από το τύπου ΙΙΙ εκκριτικό σύστημα της pseudomonas syringae

Abstract

The subject of this work is the structural study of the HrcQB protein from the plant pathogenic bacterium Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Interestingly, high sequence conservations between the HrcQB and homologues from plant and animal pathogens are concentrated at the carboxy-terminal part (79 residues) where our crystallographic study focused. HrcQB is a conserved component of the type III secretion apparatus in Gram-negative bacteria with homologous proteins participating in the export mechanism for the flagellum assembly. The method of X-ray crystallography was used for structure determination. Initially, the full length HrcQB protein, overexressed in Escherichia coli cells, was purified by chromatography. The molecule was very sensitive to proteolysis even in the presence of protein inhibitors at low temperatures. After the optimization of the purification scheme, stable and pure protein was produced. However, all the crystallization attempts were unsuccessful. Subsequently, we focused on the 79 residues of the C-terminal region (HrcQB-C) where significant similarities with the homologous proteins are observed. The HrcQB-C is a stable molecule and was crystallized with the vapour diffusion method from MPD and Mg(AcO)2. The crystals were thin plates and most of them exhibited crystal lattice defects that were reflected in the diffraction patterns. All attempts for optimizing the crystals’ quality or finding another crystal form remained unsuccessful. The bad quality of the majority of the crystals made the solution of the phase problem difficult. We did not find any useful isomorphous heavy atom derivative while the Multiple Anomalous Diffraction technique (MAD) was successful only after the mutation of a leucine in the protein interior to a methionine and then substitution of this methionine by selenomethionine. The substituted mutant was isolated and crystallized without significant deviations from the corresponding conditions of the native protein. The structure was determined from three data sets which were collected at three wavelengths around the absorption edge of selenium and was refined to 2.3 A resolution. HrcQB-C is an elongated, gently curved homotetramer which can be characterized as an overwhelmingly beta structure. The four monomers assemble into two tightly bound homodimers which are packed together to form a dimer of dimers. There are three indications which support that the tetramer is the biologically relevant molecule: (i) A relatively large, total surface area (~1200 A2) is buried upon tetramer formation via dimer-association. (ii) The tetramer is stabilized by several hydrogen bonds. (iii) The Stokes radius of the protein in solution which was estimated by size exclusion chromatography is in excellent agreement with the value calculated from the crystal structure of the whole tetramer. It is worth noting that the distribution of the conserved residues on the molecular surface is markedly asymmetric, with the majority of them being concentrated on the concave side of the tetramer The striking analogies between HrcQB and its flagellum homologous FliN protein may support the hypothesis that HrcQB participates in the formation of a C-ring like assembly.

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η δομική μελέτη της πρωτεΐνης HrcQB από το φυτοπαθογόνο βακτήριο Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Έμφαση δόθηκε στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης (79 κατάλοιπα) στο οποίο εντοπίζεται υψηλή αμινοξική συντήρηση με ομόλογες από άλλα φύτο- και ζωοπαθογόνα. Η πρωτεΐνη αποτελεί συντηρημένο μέλος της τύπου ΙΙΙ εκκριτικής μηχανής των Gram-αρνητικών βακτηρίων ενώ ομόλογες πρωτεΐνες συμμετέχουν επίσης στο μηχανισμό βιογένεσης του μαστιγίου. Για τον προσδιορισμό της δομής χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ. Αρχικά, η πλήρους μήκους HrcQB απομονώθηκε από κύτταρα Escherichia coli που την υπερέκφραζαν. Γρήγορα διαπιστώθηκε ότι είναι ένα μόριο ιδιαίτερα ευαίσθητο σε πρωτεόλυση. Προσπάθειες για τη βελτιστοποίηση της πορείας απομόνωσης κατέληξαν σε ένα σχήμα καθαρισμού που απέδιδε σχετικά σταθερό και καθαρό προϊόν. Παρόλα αυτά, όλες οι προσπάθειες κρυστάλλωσης της πρωτεΐνης απέβησαν άκαρπες. Στη συνέχεια, η προσοχή μας εστιάστηκε στα 79 κατάλοιπα του καρβοξυτελικού άκρου (HrcQB-C) στα οποία συγκεντρώνονται υψηλές ομοιότητες με τις άλλες ομόλογες πρωτεΐνες. Η HrcQB-C που είναι ιδιαίτερα σταθερό μόριο, κρυστάλλωσε με τη μέθοδο διάχυσης ατμών από MPD και Mg(AcO)2. Οι κρύσταλλοι είχαν σχήμα λεπτής πλάκας και οι περισσότεροι από αυτούς παρουσίαζαν ανωμαλίες στο κρυσταλλικό τους πλέγμα όπως έγινε αντιληπτό από τα προβληματικά διαγράμματα περίθλασης που παρήγαγαν. Προσπάθειες να βελτιωθεί η ποιότητα αυτών των κρυστάλλων ή να βρεθούν άλλες συνθήκες κρυστάλλωσης ήταν ανεπιτυχείς. Οι κακής ποιότητας κρύσταλλοι δυσχέρηναν την επίλυση του προβλήματος των φάσεων. Η εύρεση χρήσιμου παραγώγου βαρέως μετάλλου στάθηκε αδύνατη ενώ η τεχνική Multiple Anomalous Diffraction (MAD) κατέληξε σε επιτυχία μόνο μετά τη μετάλλαξη μιας λευκίνης στο εσωτερικό της δομής σε μεθειονίνη και την εν συνεχεία υποκατάσταση της μεθειονίνης από σεληνομεθειονίνη. Το υποκατεστημένο μετάλλαγμα απομονώθηκε και κρυστάλλωσε χωρίς σημαντικές αποκλίσεις από το φυσικό μόριο. Η δομή προσδιορίστηκε από ένα σύνολο δεδομένων που συλλέχτηκε σε τρία μήκη κύματος, στην περιοχή του μεγίστου απορρόφησης του σεληνίου και βελτιστοποιήθηκε μέχρι τη διακριτικότητα των 2.3 A. Η κρυσταλλική δομή της HrcQB-C είναι ένα επίμηκες, ελαφρά κυρτωμένο ομοτετραμερές με κύριο στοιχείο δευτεροταγούς δομής την β-πτυχωτή επιφάνεια. Τα τέσσερα μονομερή συναθροίζονται σε δύο διμερή που πακετάρονται μαζί και σχηματίζουν ένα διμερές διμερών. Το τετραμερές σταθεροποιείται με αρκετούς δεσμούς υδρογόνου. Επιπλέον, το σχετικά μεγάλο εμβαδό της μεσεπιφάνειας μεταξύ των διμερών (~1200 A2) και η συμφωνία της υδροδυναμικής ακτίνας της HrcQB-C σε διάλυμα -όπως εκτιμήθηκε από χρωματογραφία μοριακής διήθησης- με την υδροδυναμική ακτίνα που υπολογίζεται για το τετραμερές, φαίνεται να υποστηρίζουν την άποψη ότι το τετραμερές είναι το βιολογικά ενεργό μόριο. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η κατανομή των συντηρημένων αμινοξέων στην επιφάνεια της δομής είναι πολωμένη με την πλειοψηφία τους να συγκεντρώνεται στην κοίλη πλευρά του τετραμερούς. Τέλος, οι αναλογίες ανάμεσα στην HrcQB-C και την πρωτεΐνη FliN του μαστιγίου φαίνεται να υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η HrcQB-C συμμετέχει σε μια υπερμοριακή δομή σχήματος δακτυλίου ανάλογη του κυτταροπλασματικού δακτυλίου στον οποίο έχει δειχτεί ότι συμμετέχει η FliN. Στο πλαίσιο αυτό διερευνούμε πιθανούς τρόπους διευθέτησης των μορίων της HrcQB-C που να οδηγούν σε μια τέτοια δομή.