Ανάπτυξη και εφαρμογή της διαγονιδιακής τεχνολογίας στην εξελικτική αναπτυξιακή βιολογία αρθροπόδων

Abstract

Molecular genetic analysis in model organisms, including nematodes (Caenorhabditis), insects (Drosophila) and vertebrates (mouse), have revealed that key aspects of body patterning are regulated by similar developmental genes and genetic circuits in these diverse animals. The developmental function and evolution of these conserved genes and regulatory pathways has provided a framework for studying morphological evolution. Arthropods (insects, crustacea, myriapods, chelicerates) are favored as testing ground for evolutionary-developmentalcomparisons, because of their incredible diversity, our in-depth knowledge of Drosophila and their relatively well-known phylogenies. Such studies have relied so far on the isolation and comparison of homologous genes and their expression patterns among different species, together with their functional comparison, albeit exclusively in Drosophila. This approach has produced valuable information concerning the molecular mechanisms that underlie morphological diversity.However, it does not allow functional analysis in non-model species, thus precluding the isolation of new genes or the identification of new gene functions. The establishment of broadly applicable genetic transformation systems allows manipulations in species, that have not been genetically tractable in the past. The first part of this thesis describes the application of transgenic technologyto two non-model arthropod species, the red flour beetle Tribolium castaneum and, for the first time, to a crustacean species, the amphipod Parhyale hawaiensis. The genetic transformation of these species was achieved by using the transposable element Minos, combined with a set of versatile genetic tools including a selection of marker genes and transposase sources. A number of quantitative and qualitative parameters were examined, that confirmed the specificity of Minos transposition mechanism and its utility as a transformation vector. Although the protocols formicroinjections and breeding varied considerably, depending on the lifestyle and mode of development of each organism, transformation efficiencies were high in both species. The second part of the thesis describes the use of transgenic technology for the functional comparison of cis-regulatory elements from the Drosophila Distal-less gene in Tribolium and Parhyale. Given that Distal-less displays a conserved role in the formation of animal limbs, this study aimed to decipher the molecular changes that are responsible for the evolution of arthropod limb number. In addition, the latter section describes the isolation and characterization of active cis-regulatory sequences from Parhyale hsp70 genes, that will be used in the near future to conditionally mis-express genes of interest in the amphipod.

Μοριακές γενετικές µελέτες σε οργανισµούς-µοντέλα (ποντίκι, Drosophila, Caenorhabditis) φανέρωσαν ότι, παρά τις εκτεταµένες διαφορές στη µορφολογία τους, χτίζονται βάση κοινών αναπτυξιακών προγραµµάτων. Η ανακάλυψη αυτή έθεσε ένα πλαίσιο για τη µελέτη της εξέλιξης της µορφολογίας των οργανισµών µέσω της ανάλυσης της λειτουργίας και της εξέλιξης των συντηρηµένων ρυθµιστικών γονιδίων και αναπτυξιακών µονοπατιών. Τα αρθρόποδα (έντοµα,καρκινοειδή, µυριάποδα, χηληκερωτά) αποτελούν πρόσφορο πεδίο για την πραγµατοποίηση εξελικτικών-αναπτυξιακών συγκρίσεων, χάρη στην τεράστια ποικιλοµορφία τους, τις εκτεταµένες γνώσεις µας για τη Drosophila και τη σχετικά καλή κατανόηση των φυλογενετικών τους σχέσεων. Οι µελέτες αυτές συνίστανται συνήθως στην κλωνοποίηση οµόλογων γονιδίων, τη σύγκριση τηςαλληλουχίας και του προτύπου έκφρασής τους µεταξύ των οργανισµών και τη σύγκριση της λειτουργίας τους αποκλειστικά στη Drosophila. Η παραπάνω προσέγγιση έχει συνεισφέρει µέχρι τώρα σηµαντικές πληροφορίες για τους µοριακούς µηχανισµούς που ευθύνονται για τη µορφολογική διαφοροποίηση των ζώων. Εντούτοις, δεν επιτρέπει την ανάλυση της γονιδιακής λειτουργίας σε µηµοντέλα-οργανισµούς και την αποκάλυψη νέων γονιδίων ή νέων γονιδιακών λειτουργιών. Ο περιορισµός αυτός µπορεί να ξεπεραστεί µε τη βοήθεια της διαγονιδιακής τεχνολογίας, που βρίσκει πολλές εφαρµογές στη γενετική ανάλυση. Το πρώτο µέρος της παρούσας διατριβής πραγµατεύεται την επέκταση της διαγονιδιακής τεχνολογίας σε δύο µη µοντέλα-αρθρόποδα, το κολεόπτερο έντοµο(σκαθάρι) Tribolium castaneum, και το πρώτο καρκινοειδές που µετασχηµατίζεται, το αµφίποδο Parhyale hawaiensis. Ο γενετικός µετασχηµατισµός αυτών των ειδών επιτεύχθηκε µε τη χρήση του µεταθέσιµου γενετικού στοιχείου Minos και µε τη χρήση γενετικών εργαλείων (γονίδια διάκρισης, πηγές τρανσποζάσης) ευρείας εφαρµογής. Και στις δύο περιπτώσεις ελέγχθηκαν ποιοτικές και ποσοτικές παράµετροι που απέδειξαν την πιστότητα του µηχανισµού µετάθεσης του Minosκαι την πρακτικότητά του ως φορέα διαγονιδίων. Παρά τις εκτεταµένες τροποποιήσεις στα πρωτόκολλα µικροένεσης και καλλιέργειας των δύο οργανισµών, που ήταν απαραίτητες λόγω του διαφορετικού τρόπου ζωής και ανάπτυξής τους, οι συχνότητες µετασχηµατισµού κυµάνθηκαν σε υψηλά επίπεδα και στα δύο είδη. Το δεύτερο µέρος της διατριβής πραγµατεύεται την πρώτη εφαρµογή της παραπάνω τεχνολογίας για τη συγκριτική µελέτη της ενεργότητας cis-ρυθµιστικώναλληλουχιών του δροσοφιλικού γονιδίου Distal-less στο Tribolium και τον Parhyale. To γονιδίο Distal-less έχει έναν πολύ συντηρηµένο ρόλο στην ανάπτυξη των εξαρτηµάτων του σώµατος και µε την παραπάνω προσέγγιση επιχειρήθηκε η διελεύκανση των µοριακών αλλαγών, που ευθύνονται για την εξέλιξη του αριθµού των ποδιών µέσα στα αρθρόποδα. Τέλος, περιγράφεται η αποµόνωση και οχαρακτηρισµός cis-ρυθµιστικών περιοχών από γονίδια hsp70 του Parhyale, οι οποίες θα χρησιµοποιηθούν στο άµεσο µέλλον για τη λειτουργική ανάλυση αναπτυξιακών παραγόντων µέσω της εκτοπικής έκφρασής τους στο αµφίποδο.